人參皂苷Rg1抗血管內(nèi)膜增生與其抗氧化和上調(diào)eNOS表達(dá)作用的關(guān)系

高 楊，吳 芹，楊丹莉，鄧 江，黃燮南

(貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州遵義 563000)

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入治療 (PCI)已成為治療冠心病的重要手段，然而，PCI術(shù)后存在的再狹窄問題卻嚴(yán)重影響了其遠(yuǎn)期療效［1］。一般認(rèn)為，血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖、肥大、遷移是血管術(shù)后再狹窄等的病理基礎(chǔ)［2］。已有研究表明，人參皂苷Rg1(Rg1)能抑制腫瘤壞死因子-α所致VSMC增殖［3－4］。我們先前的研究也證實(shí)，人參總皂苷及Rg1均能抑制球囊損傷所致大鼠頸動脈內(nèi)膜增厚［5－6］，在培養(yǎng)的 VSMC，人參總皂苷對血小板源性生長因子誘導(dǎo)的VSMC增殖也具有抑制作用［7］。然而，VSMC增殖受多種因素的調(diào)控，其中，氧化應(yīng)激［8］和一氧化氮 (NO)形成［9］均明顯影響 VSMC增殖。因此，本研究擬觀察Rg1的抗血管內(nèi)膜增生作用與其抗氧化應(yīng)激和促NO生成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ♂ SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量300～350 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供［許可證號:SCXK-(軍)2007-017］。

1.2 藥品及試劑 Rg1:北京奧明興業(yè)科技有限責(zé)任公司提供 (純度95%);SOD、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、β-actin引物、TRIzol(TaKaRa生物工程公司);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒(Applied Biosystems公司);SYBR?GREEN PCR Master Mix(Warrington WA14SR.UK);RNA純化試劑盒 (上海華舜生物工程有限公司)。

1.3 儀器 Fogarty導(dǎo)管(美國edwards lifescience公司);Leica光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(德國Leica Microsystems Ltd);Mastercycler Gradient PCR儀、Centrifuge 5417R/5415D離心機(jī) (德國Eppendorf公司);icycler熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠頸總動脈球囊損傷模型的制備 大鼠用20%水合氯醛 (2 ml·kg－1)腹腔注射麻醉后仰臥位固定，用碘伏消毒頸部皮膚并作前正中切口，分離左頸總動脈和頸外動脈，用血管夾阻斷前者近心端和左頸內(nèi)動脈;結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端并在其近心端剪一小口，將2 F球囊導(dǎo)管插入去除血管夾后的頸總動脈起始部，注入約0.1 ml生理鹽水使球囊略充盈，緩慢推拉球囊導(dǎo)管3次以剝脫頸動脈內(nèi)皮，負(fù)壓回抽生理鹽水，退出導(dǎo)管，結(jié)扎左頸外動脈，縫合皮膚切口。假手術(shù)組除不插入球囊導(dǎo)管外，其余操作與模型組相同。術(shù)后每只大鼠注射12萬U芐星青霉素預(yù)防感染，清醒后置籠喂養(yǎng)。

1.4.2 動物分組及取材 大鼠隨機(jī)分5組:假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水;3個給藥組造模后分別給 Rg1 4、8、16 mg·kg－1。術(shù)后次日腹腔注射給藥，連續(xù)14 d。最后1次給藥的次日，將大鼠麻醉后取血用于SOD、MDA檢測，并迅速取出損傷的左頸總動脈，用預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，取中間段標(biāo)本放入10%中性福爾馬林中固定24 h，石蠟包埋后用于形態(tài)學(xué)觀察。剩余標(biāo)本用濾紙吸干后，立即置液氮中速凍，然后放－70℃冰箱中凍存用于Real-Time RT-PCR檢測。

1.4.3 SOD活性和MDA含量測定 按相應(yīng)試劑測試盒說明操作。

1.4.4 病理學(xué)組織觀察 將上述石蠟包埋標(biāo)本切片，行蘇木精－伊紅 (H.E.)染色，Leica光學(xué)顯微鏡下觀察血管腔形態(tài)、內(nèi)膜增厚情況，并拍照記錄。用Q Win圖像處理與分析系統(tǒng)測定新生內(nèi)膜面積和中膜面積，并計算內(nèi)膜面積/中膜面積比值，每個標(biāo)本觀察3張切片，取平均值。

1.4.5 Real-Time RT-PCR 檢測 VSMC 中 eNOS mRNA的表達(dá) 取冷凍血管標(biāo)本置于0.5 ml TRIzol液中，用研磨杵充分勻漿至組織完全裂解，在上述含有樣品的Eppendorf(EP)管中加入0.2 ml氯仿，快速搖勻，以12 000×g·min－1在4 ℃下離心10 min，取出上清液，小心吸取上層水相置于另一無菌的新EP管中，加等量異丙醇，輕搖混勻后，室溫靜置10 min，再以12 000×g·min－14℃離心10 min，肉眼可見白色半透明的細(xì)胞總RNA沉于管底，棄去上清液。加入75%乙醇0.5 ml，以12 000×g·min－1在4℃下離心10 min，小心棄去乙醇。將EP管倒置于濾紙上，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥，至乙醇完全揮發(fā)，加DEPC水100 μl溶解。RNA純化后進(jìn)行樣品純度鑒定。兩步法逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)如下:首先從基因庫GeneBank中查出相關(guān)引物序列，由TaKaRa生物工程公司合成相應(yīng)引物(見Tab 1)。

Tab 1 Primer pairs used in Real-Time PCR

PCR反應(yīng)體系為20 μl第一步，95℃×10 min;第二步，95℃ ×15 s，退火溫度 ×1 min，循環(huán)45次。結(jié)果分析處理(相對定量法)，以Ct值為統(tǒng)計參數(shù)依次計算下列數(shù)據(jù):(1)Ct average=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復(fù)管);(2)dCt=Ct average－中間值;(3)基因的表達(dá)=2^(－dCt);(4)相對定量=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)。

Fig 1 Effects of Rg1 administration on morphological changes of ballon-injured carotid artery of rats

2 結(jié)果

2.1 Rg1對大鼠頸動脈球囊損傷模型血管形態(tài)學(xué)變化的影響

2.1.1 H.E.染色血管形態(tài)學(xué)變化及Rg1對其影響

光鏡下，與假手術(shù)組(Fig 1A)比較，可見球囊損傷的各組血管標(biāo)本均有不同程度的內(nèi)膜增厚，管腔狹窄，大量新生內(nèi)膜形成，各處新生內(nèi)膜厚薄不一，以模型組(Fig 1B)最為嚴(yán)重。Rg1(4、8、16 mg·kg－1)給藥各組較模型組新生內(nèi)膜厚度明顯減小(Fig 1C，D，E)。

2.1.2 Rg1對大鼠球囊損傷后頸動脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響 H.E.染色切片經(jīng)圖像分析的結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組的新生內(nèi)膜面積和內(nèi)膜面積/中膜面積比值均分別增加了十多倍。Rg1(4、8、16 mg·kg－1)給藥可呈劑量依賴性減輕球囊損傷所致新生內(nèi)膜增厚(P＜0.01)，見Tab 2。

Tab 2 Effects of Rg1 administration on neointimal area and the ratio of neointimal area/media area in balloon-injured carotid artery of rats(±s，n=6)

Tab 2 Effects of Rg1 administration on neointimal area and the ratio of neointimal area/media area in balloon-injured carotid artery of rats(±s，n=6)

##P ＜0.01 vs sham;＊＊P ＜0.01 vs model

Group Neointimal area/μm2 Neointimal area/media area Sham 6774.67 ±1094.84 0.13 ±0.01 Model 105020.7 ±27616.15## 1.71 ±0.28##Rg1 4 mg·kg－1 50539.68 ±27920.20＊＊ 0.81 ±0.45＊＊Rg1 8 mg·kg－1 41533.91 ±23274.37＊＊ 0.67 ±0.29＊＊Rg1 16 mg·kg－1 28434.56 ±17236.42＊＊ 0.45 ±0.27＊＊

2.2 大鼠血漿中SOD活力的變化 Tab 3的結(jié)果表明，模型組較假手術(shù)組SOD活力降低了22%(P＜0.01)，Rg1(4、8、16 mg·kg－1)各給藥組與模型組比較，該指標(biāo)分別升高了21%、23%、24%(P＜0.05)，3個劑量組間呈一定的劑量依賴性趨勢。

Tab 3 Effects of Rg1 administration on SOD activities in plasm of rats with balloon-injured carotid artery(±s)

Tab 3 Effects of Rg1 administration on SOD activities in plasm of rats with balloon-injured carotid artery(±s)

##P＜0.01 vs sham;*P＜0.05 vs model

Group n SOD/kU·L －1 Sham 8 104.30 ±11.37 Model 6 81.71 ±8.60##Rg1 4 mg·kg－1 8 98.68 ±4.99*Rg1 8 mg·kg－1 8 100.71 ±2.97*Rg1 16 mg·kg－1 7 101.62 ±7.20*

2.3 大鼠血漿中MDA含量的測定 模型組大鼠血漿中 MDA 的含量為 14.42 μmol·L－1，較假手術(shù)組約升高了168%(P＜0.01);另一方面，Rg1(4、8、16 mg·kg－1)各給藥組的MDA含量均較模型組明顯降低(P＜0.01)，且3個劑量組間呈一定的劑量依賴關(guān)系(Tab 4)。

Tab 4 Effects of Rg1 administration on MDA level in

blood plasm of rats with balloon-injured carotid artery(±s)

##P ＜0.01 vs sham;＊＊P ＜0.01 vs model

2.4 Rg1對球囊損傷后血管壁eNOS mRNA表達(dá)的影響 Real-Time RT-PCR檢測結(jié)果顯示，球囊擴(kuò)張損傷頸動脈可明顯下調(diào)eNOS mRNA表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組的eNOS mRNA表達(dá)僅為前者的4%(P＜0.01)。Rg1 4 mg·kg－1對 eNOS mRNA表達(dá)下調(diào)雖無統(tǒng)計學(xué)上明顯的改善作用(P＞0.05)，但仍有上調(diào)的趨勢，當(dāng)其劑量為8、16 mg·kg－1時，便能明顯上調(diào)由球囊損傷所降低的eNOS mRNA表達(dá)，使之分別恢復(fù)到假手術(shù)組的54%和56%(P＜0.01)。

Fig 2 Effects of Rg1 administration on the expression of eNOS mRNA in balloon-injured carotid artery of rats(±s，n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，Rg1 4，8，16 mg·kg－1給藥兩周，可明顯改善球囊損傷所致以血管新生內(nèi)膜增厚為主的形態(tài)學(xué)變化，提示其對血管內(nèi)膜異常增生有抑制作用。

研究表明，氧化應(yīng)激通過活化巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和生長因子，刺激基質(zhì)重塑和平滑肌細(xì)胞增殖;活性氧還可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶參與基質(zhì)重塑，導(dǎo)致新的細(xì)胞外基質(zhì)和平滑肌細(xì)胞的積聚以致新生內(nèi)膜的形成，從而引起球囊損傷后管腔狹窄［8］。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為與AS及經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈形成術(shù)(PCI)后再狹窄的發(fā)病有密切關(guān)系，抑制氧化應(yīng)激便有可能抑制血管損傷后的再狹窄［10－11］。已有研究發(fā)現(xiàn)［12］，每天給小劑量抗氧化劑普羅布考(probucol)可減輕PCI所致血管再狹窄的發(fā)生率和嚴(yán)重性。業(yè)已明了，SOD活力的高低可反映機(jī)體內(nèi)抗自由基水平的高低。而測定MDA含量可間接反映自由基對機(jī)體的損傷程度。我們的實(shí)驗(yàn)表明，Rg1呈劑量依賴性地降低頸動脈球囊損傷后大鼠血漿中MDA的含量，而提高SOD的活力。表明Rg1能減輕氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用，該作用可能是其抗球囊損傷所致血管內(nèi)膜增生的機(jī)制之一。

目前，NO抑制VSMC增殖的作用已得到充分肯定。有研究表明［9］，NO生成藥如硝普鈉等能呈劑量依賴性地抑制VSMC增殖，給予NO前體藥左旋精氨酸、口服NO供體藥嗎多明(molsidomine)和長時間直接吸入NO均能明顯減輕球囊損傷所致血管內(nèi)膜增厚。還有文獻(xiàn)報道，損傷的VSMC在轉(zhuǎn)染了eNOS基因后能充分分化，降低細(xì)胞的增殖率［13］，從而肯定了eNOS在抑制細(xì)胞增殖中的作用。

本室既往研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的新生乳鼠心肌細(xì)胞，Rg1可促進(jìn)NO釋放，參與其抗心肌細(xì)胞肥大效應(yīng)［14］;利用縮窄腹主動脈所致左室心肌肥厚模型的研究也發(fā)現(xiàn)，NO生成在Rg1的抗心肌肥厚中發(fā)揮一定作用［15］。在本研究中，我們雖未能測定血管壁NO濃度的變化，但發(fā)現(xiàn)模型組eNOS mRNA表達(dá)量僅為假手術(shù)組的4%，而Rg1給藥后，特別是8 mg·kg－1和 16 mg·kg－1組，大鼠頸動脈 eNOS mRNA 表達(dá)量可恢復(fù)到假手術(shù)組的一半以上。該結(jié)果似能表明，Rg1可通過改善和恢復(fù)大鼠球囊損傷后血管壁eNOS的表達(dá)，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，減輕內(nèi)膜增殖，成為其抗囊損傷后血管再狹窄的另一個機(jī)制。

綜上所述，Rg1抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜異常增生的作用，可能與其抗氧化應(yīng)激和上調(diào)NOS mRNA，促進(jìn)NO生成有關(guān)。

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