線粒體乙醛脫氫酶在大鼠糖尿病心肌病中的表達(dá)及意義

王曉梅，葉紅偉，康品方，王洪巨，高 琴，李正紅

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌 埠 233030;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)由Hamby等［1］于1974年首次提出，即由糖尿病引起心臟微血管病變、心肌代謝紊亂和心肌纖維化等所致的心肌廣泛結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)。迄今證據(jù)表明，部分糖尿病患者出現(xiàn)的心力衰竭由DC所致［2］。心血管疾病已成為糖尿病患者的“頭號殺手”。如何有效對抗糖尿病心肌損傷，促進(jìn)心肌功能恢復(fù)，對提高糖尿病病人的生存率具有非常重要的臨床意義。

乙醛脫氫酶 2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶［3］。最早報(bào)道ALDH2參與乙醇代謝，乙醇在乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成乙醛，ALDH2催化乙醛生成乙酸;同時(shí)分解乙醛代謝產(chǎn)物4-羥壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)，減輕乙醛及其代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的氧化損傷。Murata等［4］發(fā)現(xiàn)ALDH2基因缺失使糖尿病患者血糖增高。外源性ALDH2激動(dòng)劑Alda-1提高ALDH2活性可抗大鼠心肌缺血/再灌注損傷，發(fā)揮保護(hù)作用，提示ALDH2可能成為研究心肌保護(hù)機(jī)制的一個(gè)新方向［5－6］。ALDH2在糖尿病心肌病不同病程階段如何改變，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察糖尿病大鼠不同病程階段心肌ALDH2的變化，探討ALDH2在糖尿病心肌病中的作用，并進(jìn)一步推測其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡健康♂ Sprague-Dawley大鼠體質(zhì)量(200±20)g，清潔級，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥品和試劑 鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司)，血糖測定儀及試紙(臺(tái)欣生物科技研發(fā)股份有限公司)，TRIzol試劑購自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 PCR試劑盒購自MBI Fermentas公司;ALDH2、β-actin引物均由上海生工生物工程公司合成。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(hydroxyproline，Hp)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。熒光定量PCR(Real-time qPCR)試劑盒購自天根公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 生物信號采集處理系統(tǒng)，Med-Lab-U/4C，南京美易科技有限公司;梯度PCR擴(kuò)增儀，TGradient型，德國Biometra公司;熒光定量PCR儀，StepOnePlus Real-Time PCR System，ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對照組(Control)18只;糖尿病組(DM)24只，共42只。DM組大鼠空腹12h后腹腔注射 STZ 50 mg·kg－1(0.1 mol·L－1，pH=4.4的枸櫞酸鹽緩沖液在冰浴下配制成11 g·L－1的STZ 溶液)，72 h后測空腹血糖≥16.7 mmol·L－1為造模成功，低于此值的棄之，隨機(jī)分為DM 4周組、8周組、12周組，每組8只。Control組大鼠腹腔注射0.1 mol·L－1，pH=4.4 的枸櫞酸鹽緩沖液，隨機(jī)分為4周組、8周組、12周組，每組6只。給予大鼠充足飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)持續(xù)12周，實(shí)驗(yàn)過程中每4周監(jiān)測血糖1次。

1.2.2 大鼠離體心臟灌流 大鼠斷頭后開胸迅速取出心臟，置于4℃改良 Krebs-Henseleit(K-H)液中，迅速轉(zhuǎn)移固定于Langendorff灌流裝置，K-H液常規(guī)恒壓(10.13 kPa)灌流。改良K-H液成分如下(mmol·L－1):NaCl 118.0，KCl 4.7，K2HPO41.2，MgSO41.2，NaHCO325.0，CaCl21.25，葡萄糖 11.0，pH 7.3～7.4，以95%O2+5%CO2飽和，維持灌流液溫度37℃，切開左心耳，將充水乳膠囊由此插入至左心室，囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器，由MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)記錄和分析。

1.2.3 左心室功能評價(jià) 向插入左心室內(nèi)的乳膠囊注水使左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)維持于 0.53 kPa ～1.07 kPa，平衡30 min，連續(xù)記錄實(shí)驗(yàn)過程中左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、心率(heart rate，HR)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax)等各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4 心肌組織SOD活性、MDA含量測定 心肌灌流結(jié)束后，迅速摘取心臟，濾紙吸干，取左心室心肌組織約100 mg，－80℃冰箱保存。組織研磨器內(nèi)冰浴制備10%勻漿，檢測蛋白含量(考馬斯亮藍(lán)法)、SOD活性(黃嘌呤氧化酶法)和MDA含量(硫代巴比妥鈉，TBA法)。

1.2.5 心肌組織羥脯氨酸含量測定 取左室心肌組織約100 mg，－80℃冰箱保存，按照試劑盒說明書依次操作測定Hp含量。

1.2.6 Real-time qPCR 實(shí)時(shí)監(jiān)測 ALDH2 mRNA 表達(dá) 心肌灌流結(jié)束后，快速取左心室前壁心尖部組織約100 mg置液氮速凍后，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。以正常大鼠左心室前壁心尖部組織作為對照，采用TRIzol一步法提取組織總 RNA，取總RNA 3 μg為模板，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以800 ng cDNA，11.5 μl的 RealMasterMix和 20×SYBR solution的混合物，上下游引物各1 μl，再加dd H2O 到25 μl體系。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性1 min后，以① 95℃15 s變性;②52.9℃ 20 s退火，③ 68℃ 50 s延伸，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。引物序列見Tab 1。ALDH2 mRNA的變化分析采用2-△△ct法。

Tab 1 Primer sequences for each gene of real-time qPCR

2 結(jié)果

因造模失敗、實(shí)驗(yàn)中途死亡等，最后進(jìn)入分析的大鼠40只:Control 4周組、8周組、12周組各6只，DM 4周組8只，DM 8周組7只，DM 12周組7只。除Control組外，DM組大鼠均出現(xiàn)多食、多飲、多尿、消瘦等癥狀。

2.1 大鼠體重、心臟重及心體比的改變 Control組大鼠隨時(shí)間的延長大鼠體重和心臟重均增加(P＜0.01);與Control組相同時(shí)間段比較，DM 4周、8周和12周大鼠的體重和心臟重均減少(P＜0.01)，且DM組隨病程延長，體重進(jìn)一步降低;與Control組相比，DM 4周組心臟/體重比無明顯改變，但DM 8周和DM 12周組心臟/體重比明顯高于Control相同時(shí)間段組(P＜0.01，Tab 2)，且隨病程延長，DM組心臟/體重比逐漸增大，而Control組大鼠心臟/體重比無明顯變化。

Tab 2Changes of body weight，heart weight and their ratio in different groups(±s)

Tab 2Changes of body weight，heart weight and their ratio in different groups(±s)

＊＊P ＜0.01 vs age-matched control;##P ＜0.01 vs group-matched 4 wk;ΔΔP ＜0.01 vs group-matched 8 wk

Body weight/g 4 wk 8 wk 12 wk Heart weight/mg 4 wk 8 wk 12 wk H/B ratio/mg·g－1 4 wk 8 wk 12 wk Control 382.67±5.95 440.53±3.84## 525.00±5.36##ΔΔ 1392.66±35.76 1528.63±43.25## 1861.7±181##ΔΔ3.64±0.04 3.47±0.07 3.54±0.10 DM 235.58±6.43＊＊ 185.46±3.85＊＊## 147.50±5.42＊＊##ΔΔ 925.45±22.63＊＊ 830.34±37.93＊＊ 784.68±18.75＊＊ 3.93±0.21 4.48±0.11＊＊## 5.32±0.06＊＊##ΔΔ

Tab 3Changes of hemodynamic parameters in different stages of different groups(±s)

Tab 3Changes of hemodynamic parameters in different stages of different groups(±s)

＊＊P ＜0.01 vs age-matched control;##P ＜0.01 vs DM 4 wk;ΔΔP ＜0.01 vs DM 8 wk

LVDP/kPa 4 wk 8 wk 12 wk+dp/dtmax/kPa·s－1 4 wk 8 wk 12 wk－ dp/dtmax/kPa·s－1 4 wk 8 wk 12 wk Control 10.0±0.69 9.98±1.29 11.01±0.71 296.07±17.82 290.73±12.57 318.29±46.08 149.11±15.45 153.97±34.05 162.40±41.53 DM 8.96±0.70 6.39±0.59＊＊## 4.80±1.40＊＊##ΔΔ 280.84±17.49 119.74±19.77＊＊## 79.68±15.81＊＊##ΔΔ 141.67±10.85 88.70±4.68＊＊## 5.32±0.06＊＊##ΔΔ

Fig 1 Changes of SOD activity(A)，MDA content(B)and Hp content(C)in different stages of different groups

2.2 左心室功能的變化 與Control組同時(shí)間段相比，DM 4周組無明顯改變，DM 8周和DM 12周組大鼠LVDP和±dp/dtmax均明顯下降(P＜0.01)，且隨著病程的延長，LVDP和±dp/dtmax進(jìn)一步下降(P＜0.01，Tab 3)，表明隨著糖尿病病程的發(fā)展，心臟的收縮功能逐漸降低。

2.3 生化指標(biāo)改變 與相同時(shí)間段Control組相比，DM 4周組、8周組和12周組大鼠心肌SOD活性降低(P＜0.01)，MDA含量增高(P＜0.01)，Hp含量增加(P＜0.01);且隨病程的延長，DM組大鼠心肌SOD活性進(jìn)一步降低(P＜0.01)，MDA含量和Hp含量增加明顯(P＜0.01)，提示隨著糖尿病病程的延長，心肌的抗氧化能力逐漸下降，心肌纖維化程度逐漸增加，心肌的損傷越來越嚴(yán)重。

2.5 熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測ALDH2 mRNA的表達(dá) DM各不同病程組與同時(shí)段Control組比較，ALDH2 mRNA的表達(dá)明顯降低(P＜0.01，F(xiàn)ig 2);且隨病程的延長，DM組ALDH2 mRNA表達(dá)進(jìn)一步降低(P＜0.01)，提示隨病程加重，ALDH2的表達(dá)逐漸降低，ALDH2基因在糖尿病心肌病發(fā)展過程中與心肌損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

Fig 2 Relative expression of ALDH2 mRNAin different stages of different groups

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病發(fā)病過程中特異性的心肌受損和心臟功能改變，目前確切病因還不清楚，可能與心肌能量代謝紊亂、Ca2+超載、血管動(dòng)脈硬化、氧化應(yīng)激、高血壓及高血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

ALDH2最早報(bào)道參與乙醛的代謝。近年來有報(bào)道，在硝酸甘油耐受［7－8］和心肌缺血復(fù)灌［9］機(jī)制研究中，ALDH2可能是一種心肌保護(hù)因子，心肌ALDH2改變與氧化損傷密切相關(guān)。糖尿病病程中，通過脂質(zhì)過氧化、葡萄糖自身氧化、非酶促蛋白糖基化等多種途徑可促進(jìn)大量氧自由基的產(chǎn)生，引起心肌損傷［10］。糖尿病大鼠造模8周后心肌氧化應(yīng)激加重同時(shí)，Hamblin等［11］通過蛋白組學(xué)檢測觀察到心肌ALDH2蛋白水平降低了34%;Wang等［12］檢測到心肌ALDH2活性和表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)首次觀察了糖尿病不同病程階段心肌ALDH2的改變。結(jié)果顯示，糖尿病大鼠造模成功后4周、8周、12周，隨病程延長，大鼠心肌收縮能力逐漸降低，冠脈流出液中LDH釋放逐漸增多，心肌抗氧化能力降低，心肌ALDH2水平逐漸降低，提示糖尿病心肌ALDH2的表達(dá)與其不隨病程延長心肌損傷逐漸加重密切相關(guān)，ALDH2活性降低可能是心肌損傷加重的重要原因之一。

本實(shí)驗(yàn)中還觀察到，糖尿病大鼠心體比增大，心肌羥脯氨酸含量逐漸增高，提示心肌代償性肥厚，出現(xiàn)纖維化。心肌纖維化加重是否與ALDH2降低相關(guān)?心肌纖維化是心血管疾病病死率和發(fā)病率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。心肌肥厚的發(fā)生過程中，心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，纖維組織增生，產(chǎn)生大量的膠原和纖維素，使心肌結(jié)構(gòu)紊亂，最終導(dǎo)致心肌舒縮功能障礙。氧化應(yīng)激亦加重心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展。文獻(xiàn)報(bào)道，ALDH2轉(zhuǎn)基因小鼠中，ALDH2高表達(dá)減弱慢性酒精誘導(dǎo)的心肌纖維化［13］。Watanabe 等［14］報(bào)道羥脯氨酸可誘導(dǎo)ALDH2轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰┟摎涿赋易寤?，使ALDH2活性喪失。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨病程的延長，糖尿病大鼠心肌抗氧化能力降低，心肌纖維化加重，ALDH2表達(dá)降低，推測高血糖誘導(dǎo)的氧化損傷促進(jìn)心肌纖維化，同時(shí)使得ALDH2表達(dá)降低，纖維化又進(jìn)一步誘導(dǎo)ALDH2失活，最終引起心肌損傷，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

因此，我們得出結(jié)論，隨糖尿病病程的延長，心肌ALDH2表達(dá)逐漸降低，其機(jī)制可能與高血糖引起的抗氧化能力下降、心肌纖維化加重密切相關(guān)，這為闡明臨床糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)理及治療提供一個(gè)新的視角。

［1］Hamby R I，Lee R L，Aintablian A，et al.Diabetic cardiomyopathy［J］.JAMA，1974，229(13):1749－54.

［2］Resl M，Hülsmann M，Pacher R，et al.Heart failure in diabetes［J］.Wien Med Wochenschr，2009，159(5－6):134－40.

［3］何 嵐，彭 軍.線粒體醛脫氫酶對心臟保護(hù)作用的研究進(jìn)展

［J］.中國藥理學(xué)報(bào)，2009，25(12):1548－51.

［3］He L，Peng J.Progress of mitochondrial aldehyde dehydrogenase in cardioprotection［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(12):1548－51.

［4］Murata C，Suzuki Y，Muramatsu T，et al.Inactive aldehyde dehydrogenase 2 worsens glycemic control in patients with type 2 diabetes mellitus who drink low to moderate amounts of alcohol［J］.Alcohol Clin Exp Res，2000，24(4Suppl):5S－11S.

［5］Chen C H，Budas G R，Churchill E N，et al.Activation of aldehyde dehydrogenase-2 reduces ischemic damage to the heart［J］.Science，2008，321(5895):1493－5.

［6］Budas G R，Disatnik M H，Mochly-Rosen D.Aldehyde dehydrogenase 2 in cardiac protection:a new therapeutic target［J］?Trends Cardiovasc Med，2009，19(5):158－64.

［7］Sydow K，Daiber A，Oelze M，et al.Central role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase and reactive oxygen species in nitroglycerin tolerance and cross-tolerance［J］.Clin Invest，2004，113(3):482－9.

［8］Wenzel P，Hink U，Oelze M，et al.Role of reduced lipoic acid in the redox regulation of mitochondrial aldehyde dehydrogenase(ALDH-2)activity.Implications for mitochondrial oxidative stress and nitrate tolerance［J］.Biol Chem，2007，282(1):792－9.

［9］高 琴，姜翠榮，于 影，等.線粒體乙醛脫氫酶2在心肌缺血后處理中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(8):1088－92.

［9］Gao Q，Jiang C R，Yu Y，et al.Role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 in postconditioning induced cardioprotection［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):1088－92.

［10］Li S Y，Yang X，Ceylan-Isik A F，et al.Cardiac contractile dysfunction in Lep/Lep obesity is accompanied by NADPH oxidase activation，oxidative modification of sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase and myosin heavy chain isozyme switch［J］.Diabetologia，2006，49(6):1434－46.

［11］Hamblina M，F(xiàn)riedmanb D B，Hill S，et al.Alterations in the diabetic myocardial proteome coupled with increased myocardial oxidative stress underlies diabetic［J］.Mol Cell Cardiol，2007，42(4):884－95.

［12］Wang J，Wang H，Hao P，et al.Inhibition of aldehyde dehydrogenase 2 by oxidative stress is associated with cardiac dysfunction in diabetic rats［J］.Mol Med，2011，17(3－4):172－9.

［13］Doser T A，Turdi S，Thomas D P，et al.Transgenic overexpression of aldehyde dehydrogenase-2 rescues chronic alcohol intake-induced myocardial hypertrophy and contractile dysfunction［J］.Circulation，2009，119(14):1941－9.

［14］Watanabe S，Yamada M，Ohtsu L，et al.Alpha-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase isozymes involved in metabolic pathways of D-glucarate，D-galactarate，and hydroxy-L-proline.Molecular and metabolic convergent evolution［J］.J Biol Chem，2007，282(9):6685－95.