TF3-H4對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25－效應(yīng)性T細(xì)胞早期活化的影響

李曉娟，胡義平，劉 燕，姜志宏，劉叔文

(1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510515;2.澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門)

茶黃素是從茶葉中提取的一類苯駢酚酮的衍生物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用［1－3］。茶黃素-3，3'-雙沒(méi)食子酸酯(theaflavin-3，3'-digallate，TF3)是茶黃素的主要活性成分，本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)其水溶性低、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，將其加氫還原改善后，獲得了新化合物 1'，2'，3'，7'-四氫茶黃素-3，3'-雙沒(méi)食子酸酯(1'，2'，3'，7'-4H-theaflavin-3，3'-digallate，TF3-H4)［4］。根據(jù) CD4+T 細(xì)胞表面 分 子CD25表達(dá)的不同，可將其分為CD4+CD25－效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff)和CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞(Treg)功能不同的兩群細(xì)胞。二者均可經(jīng)由抗原、通過(guò)TCR的信號(hào)通路被活化，但活化后前者促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)，后者可抑制免疫反應(yīng)和維持機(jī)體的耐受，表現(xiàn)出不同的功能和作用［5－6，12］。觀察 TF3-H4 經(jīng)由TCR通路對(duì)兩群不同的CD4+T細(xì)胞的活化的影響，可從免疫角度探討茶黃素發(fā)揮抗炎、抗腫瘤等作用的可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察TF3-H4對(duì)兩種CD4+T細(xì)胞亞群的活化標(biāo)志CD69表達(dá)的影響，初步探索茶黃素衍生物對(duì)Teff或 Treg占優(yōu)勢(shì)疾病的可能治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)BALB/c近交系小鼠(♀，6～8周齡)購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。ConA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和β-二巰基乙醇購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。羧基熒光素雙醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Molecular Probes公司。小鼠FITC-抗CD69單抗、FITC-抗 CD4單抗、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞MACS磁珠分離試劑盒購(gòu)自德國(guó)美天旎公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BDPharMingen公司的FACSCalibur。

1.2 方法

1.2.1 TF3-H4制備 TF3-H4為淡黃色固體，是在保留茶黃素-3，3'-雙沒(méi)食子酸酯(深褐色)原有結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)及酚羥基基團(tuán)的基礎(chǔ)上，對(duì)其苯駢酚酮結(jié)構(gòu)中的七元酚酮環(huán)進(jìn)行碳環(huán)氫化還原制備而成(具體步驟省略)。

1.2.2 CD4+CD25+T 細(xì)胞和 CD4+CD25－T 細(xì)胞的分離和檢測(cè) 分離BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞，過(guò)400目網(wǎng)。按MACS磁珠分離試劑盒推薦的步驟，用一系列生物素化的抗體混合物和抗生物素微珠間接磁性標(biāo)記非CD4+T細(xì)胞，標(biāo)記的非CD4+T細(xì)胞滯留在分選柱上，未標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞通過(guò)分選柱流出而預(yù)富集CD4+T細(xì)胞。后用抗PE磁性微珠標(biāo)記富集 CD4+T細(xì)胞中 CD25－PE標(biāo)記的細(xì)胞，將CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞滯留在分選柱上，收集流出未標(biāo)記CD25－PE的CD4+CD25－T細(xì)胞。為獲得更高純度的CD4+CD25+T細(xì)胞，將分選柱移出磁場(chǎng)，CD4+CD25+T細(xì)胞作為陽(yáng)性成分洗脫之后再過(guò)一個(gè)新的分選柱，從而獲得高純度的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。磁珠分選的細(xì)胞加抗小鼠CD4-FITC單抗標(biāo)記15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD4+CD25－和CD4+CD25+T細(xì)胞純度。磁珠分離前小鼠脾臟CD4+CD25+細(xì)胞的Foxp3檢測(cè)按照小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞試劑盒(eBioscience)檢測(cè)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面早期活化標(biāo)志CD69的表達(dá) 采用直接免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞按2～4×105/孔加入96孔板，檢測(cè)TF3-H4對(duì)ConA和PDB刺激的CD4+CD25－T細(xì)胞CD69的表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)5組:正常組，ConA(2 mg·L－1)組，ConA(2 mg·L－1)+TF3-H4(20 mg·L－1)組，PDB(2× 10－7mol·L－1)組，PDB(2× 10－7mol·L－1)+TF3-H4(20 mg·L－1)組。來(lái)源于細(xì)胞膜的信號(hào)能很好地激活Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，因此觀察TF3-H4對(duì)ConA而不是PDB刺激后CD4+CD25+T細(xì)胞CD69的表達(dá)的影響。細(xì)胞按2×105/孔加入96孔板，實(shí)驗(yàn)設(shè)3組:正常組，ConA(2 mg·L－1)組，ConA(2 mg·L－1)+TF3-H4(20 mg·L－1)組。各組細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，收取細(xì)胞，離心，PBS洗兩遍，濃縮至 100 μl，加入 0.5 μg/106FITC-抗 CD69單抗?；靹蚝?，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌兩次后，重懸于200 μl的PBS中，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)及分析 用 FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，CellQuest軟件獲取數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)用CellQuest軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞純度的檢測(cè)磁珠分離前小鼠脾臟的細(xì)胞以CD4+CD25+雙陽(yáng)性的細(xì)胞設(shè)門Gate 1(Fig 1A)，分析Foxp3的表達(dá)(Fig 1B)，表明CD4+CD25+天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為高表達(dá)Foxp3陽(yáng)性的細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)分離純化后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的純度為91%(Fig 1C)，CD4+CD25－效應(yīng)性T細(xì)胞的純度為90%(Fig 1D)。

Fig 1 The purity of CD4+CD25+regulatory T cells and CD4+CD25－effector T cells

2.2 TF3-H4對(duì)CD4+CD25－效應(yīng)性T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)的影響 經(jīng)2 mg·L－1ConA和 2×10－7mol·L－1PDB 作用 12 h 后，CD4+CD25－T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)均明顯升高(Fig 2)。TF3-H4對(duì)ConA刺激的CD4+CD25－T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)具有抑制作用，而對(duì)PDB刺激的CD4+CD25－T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)沒(méi)有抑制作用(Fig 2)。

2.3 TF3-H4對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)的影響 經(jīng)2 mg·L－1ConA作用12 h后，CD4+CD25+T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)明顯升高。TF3-H4對(duì) ConA刺激的CD4+CD25+T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)有明顯的抑制作用(Fig 3)。

Fig 2 Effects of TF3-H4 on the early T cell activation marker CD69 expression in CD4+CD25－effector T cells after ConA or PDB stimulation

Fig 3 Effects of TF3-H4 on the early T cell activation marker CD69 expression in CD4+CD25+regulatory T cells after ConA stimulation

3 討論

茶黃素衍生物的抗炎、抗腫瘤作用可能與其調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能、影響機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)。為此，研究藥性更好的新茶黃素衍生物TF3-H4對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用具有重要意義。CD69是T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)通路活化的一個(gè)早期信號(hào)分子，在抗原激活后的Teff、Treg兩群細(xì)胞上的表達(dá)均明顯增加［7］。CD69分子在靜息細(xì)胞的膜表面低水平表達(dá)，但在抗原、多克隆刺激劑等作用下表達(dá)迅速增強(qiáng)，具有很高的敏感性［9］。ConA和PDB可以部分模擬抗原的作用，分別通過(guò)細(xì)胞膜上的CD3-TCR復(fù)合體和下游的PKC激酶活化效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞。此外本實(shí)驗(yàn)室還觀察到ConA能激活Treg細(xì)胞CD69的表達(dá)，并在體外促進(jìn)Treg的免疫抑制功能［8］。在絲裂原 ConA或 PDB的作用下，CD4+CD25－Teff細(xì)胞的 CD69表達(dá)均可明顯升高。但TF3-H4不抑制PDB激活的Teff細(xì)胞CD69的表達(dá)，卻能抑制ConA激活的Teff細(xì)胞CD69表達(dá)。由于ConA作用于T細(xì)胞膜上的CD3-TCR復(fù)合體、PDB作用于下游PKC激酶，二者通過(guò)不同的作用部位激活T細(xì)胞，所以TF3-H4可能主要通過(guò)作用于上游的TCR發(fā)揮對(duì)Teff的早期活化的抑制作用。

而來(lái)源于細(xì)胞膜TCR的信號(hào)能夠很好地激活與Teff功能相反的Treg細(xì)胞活化及其免疫抑制功能。以往研究發(fā)現(xiàn)［8］，ConA在Teff與Treg共培養(yǎng)體系中表現(xiàn)為促進(jìn)Treg的免疫抑制功能。本實(shí)驗(yàn)用ConA激活Treg，發(fā)現(xiàn)20 mg·L－1的TF3-H4能抑制ConA激活的Treg細(xì)胞的CD69表達(dá)。因此，TF3-H4可能也將降低Treg的免疫抑制功能，尤其是在Treg占優(yōu)勢(shì)的情況下。TF3-H4對(duì)Teff、Treg兩群功能相反的細(xì)胞早期活化均表現(xiàn)出抑制作用，提示其在兩群細(xì)胞活化不同的疾病狀態(tài)，如腫瘤和炎癥，可能發(fā)揮不同的作用。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中，效應(yīng)性T細(xì)胞的過(guò)度活化是造成免疫損傷的重要因素之一［10－11］。TF3-H4抑制Teff經(jīng)TCR途徑的免疫活化，可降低Teff的殺傷活性，起抗炎作用，減輕免疫損傷。而在Treg細(xì)胞明顯增加的腫瘤組織中［6］，TF3-H4抑制 Treg活化，可促進(jìn) Teff功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。

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