應(yīng)用胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子發(fā)育毒性的初步評(píng)價(jià)

許 華，鄧淑琴，何 清，蘇本金，江海香，黃亞?wèn)|

(暨南大學(xué)1.藥學(xué)院，2.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東廣州 510632)

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)為成纖維細(xì)胞家族的重要成員之一，具有廣泛的生物學(xué)活性，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)傷口的愈合，已在臨床用于燒傷、創(chuàng)傷等的治療。但該類藥物在臨床大劑量或長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用，特別是在育齡人群使用，是否會(huì)引起胚胎干細(xì)胞的異常分化而導(dǎo)致潛在的生殖發(fā)育毒性，令人擔(dān)憂。由于該類藥物自身的生物學(xué)特性和作用機(jī)制不同于常規(guī)的化合物，難以用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法確定其可能出現(xiàn)生殖發(fā)育毒性。本實(shí)驗(yàn)欲建立小鼠胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(EST)模型，初步判斷bFGF是否具有發(fā)育毒性，為生長(zhǎng)因子類藥物的安全用藥提供初步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，♀♂各半，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(粵)2009-0011。

1.2 細(xì)胞系 BALB/c 3T3購(gòu)自中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，ES-D3由浙江大學(xué)朱丹燕教授惠贈(zèng)。

1.3 主要試劑 bFGF，購(gòu)自廣東南海朗泰制藥有限公司，批號(hào)C20110301;堿性磷酸酶試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor;LIF)，貨號(hào) ESG1106購(gòu)自 Millipore公司;絲裂霉素C購(gòu)自Roche公司;ES細(xì)胞培養(yǎng)基(含有 15%胎牛血清 FBS，0.1 mmol·L－1β-巰基乙醇，2 mmol·L－1L-谷氨酰胺，0.1 mmol·L－1丙酮酸鈉，1%青－鏈霉素，0.1 mmol·L－1非必需氨基酸NEAA和1 000 kU·L－1LIF)，高糖 DMEM 培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青－鏈霉素)

1.4 方法

1.4.1 小鼠原代胚胎成纖維細(xì)胞的提?。?］取12.5～14.5 d的昆明種胎鼠，將軀干部分剪碎，采用胰酶多次消化的方法，取上層懸液并離心，收集細(xì)胞沉淀，即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，用高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%即可傳代。

1.4.2 飼養(yǎng)層的制備［2］取第2～4代的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠胚胎成纖維細(xì)胞用10 mg·L－1的絲裂霉素C 37℃作用3 h抑制細(xì)胞的分裂，消化后接種于質(zhì)量濃度為0.1%明膠包被的新培養(yǎng)瓶中即制備成飼養(yǎng)層。

1.4.3 小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng) 將復(fù)蘇的ES-D3接種于制備的飼養(yǎng)層中，用ES細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，每2～3天傳代至新的飼養(yǎng)層上。

1.4.4 小鼠胚胎干細(xì)胞未分化的鑒定 ESC通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、堿性磷酸酶染色及RT-PCR對(duì)ESC未分化基因Oct-4和Sox-2的表達(dá)這三方面的檢測(cè)對(duì)ESC進(jìn)行鑒定。所用引物如Tab 1。

1.4.5 bFGF 對(duì) ESC 和 3T3 的細(xì)胞毒性檢測(cè)［3］將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESC和3T3以1×104·L－1的密度分別接種到96孔板中，每孔50 μl，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同濃度的bFGF的培養(yǎng)基150 μl(0、10、20、30、40、50、60、70 和 80 mg·L－1)繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，d 3、d 5進(jìn)行更換新的含藥培養(yǎng)基，d 10時(shí)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，于波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)其吸光度值，制成濃度－反應(yīng)曲線，求出相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)生50%細(xì)胞毒性的受試物濃度，即IC50ESC和IC503T3。

Tab 1 Sequences of primers

1.4.6 bFGF對(duì) ESC分化抑制試驗(yàn)［4］用不含有LIF的ESC分化培養(yǎng)基制備成含不同濃度的bFGF的培養(yǎng)基(0、0.03、0.3、3 和 30 mg·L－1)，將差速貼壁所收集的ESC與上述濃度混勻后，以2.5×104·L－1的密度(每滴 30 μl，大約 750 個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行懸滴、懸浮、貼壁三步法培養(yǎng)。于d 10收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)ECS中未分化基因Sox-2和管家基因GADPH的表達(dá)量，并進(jìn)行灰度半定量分析，求出bFGF對(duì)ESC分化抑制率為50%時(shí)的作用濃度，即半數(shù)抑制濃度ID50ESC。

1.4.7 發(fā)育毒性的判斷 受試物發(fā)育毒性的計(jì)算公式和評(píng)價(jià)方法見(jiàn)文獻(xiàn)［5］。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用Image J分析軟件對(duì)RT-PCR凝膠圖像進(jìn)行灰度半定量分析。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胚胎干細(xì)胞未分化的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 鏡下可觀察到生長(zhǎng)在飼養(yǎng)層上的ESC呈克隆狀生長(zhǎng)，類似圓形或島嶼狀，邊緣光滑清晰，集落中細(xì)胞密集，細(xì)胞界限不清。如Fig 1。

2.1.2 堿性磷酸酶染色 將生長(zhǎng)在飼養(yǎng)層上的ESC經(jīng)NBT/BCIP染色工作液作用后，細(xì)胞克隆被染成藍(lán)色，說(shuō)明ESC處于未分化狀態(tài)。如Fig 2。

2.1.3 未分化基因的表達(dá) ESC和MEF提取所得的總RNA進(jìn)行RT-PCR，并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，ESC未分化基因Oct-4和Sox-2均有表達(dá)，表明實(shí)驗(yàn)所用的ESC處于未分化狀態(tài)。如Fig 3。

2.2 bFGF對(duì)ESC和3T3的細(xì)胞存活率的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著bFGF濃度的增加，ESC和3T3的增殖均受到明顯的抑制，并有一定的劑量依賴性;在同等濃度下，bFGF對(duì)ESC增殖的抑制作用強(qiáng)于3T3細(xì)胞，表明 ESC對(duì) bFGF的敏感性高于3T3。應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件處理數(shù)據(jù)，得出bFGF的IC50ESC和IC503T3分別為15.2 mg·L－1和 24.2 mg·L－1。如 Fig 4。

Fig 1 Embryonic stem cells cultured on mouse embryonic fibroblasts(×100)

Fig 2 Alkaline phosphatase staining of mouse embryonic stem cells(×200)

Fig 3 Expression of undifferentiated gene Sox-2 and Oct-4 in embryonic stem cells

Fig 4 Inhibitiory effect of different concentrations of bFGF on embryonic stem cells and 3T3 cells(±s，n=6)

2.3 bFGF對(duì)ESC分化的抑制作用 將PCR結(jié)果進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，如Fig 5所示，隨著bFGF作用濃度的提高，未分化基因Sox-2的表達(dá)量呈劑量依賴性增高，表明ESC分化受到抑制。通過(guò)灰度半定量分析，求出各受試物相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)生50%胚胎干細(xì)胞分化抑制作用的濃度ID50ESC為1.7 mg·L－1。

Fig 5 Expressions of Sox-2 after exposed to different concentrations of bFGF for 10 days

2.4 受試物發(fā)育毒性的判定結(jié)果 將上述所求得的IC503T3，IC50ESC和ID50ESC代入受試物發(fā)育毒性計(jì)算公式得到Ⅱ＞Ⅰ，且Ⅱ＞Ⅲ，則生長(zhǎng)因子類藥物bFGF發(fā)育毒性為二級(jí)，即有弱胚胎毒性。

3 討論

歐洲替代試驗(yàn)方法驗(yàn)證中心(European Center for Validation Alternative Methods，ECVAM)推薦的EST模型可用于外來(lái)物胚胎發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)。EST對(duì)受試物的檢測(cè)終點(diǎn)由2個(gè)部分組成，一為細(xì)胞毒性(用半數(shù)抑制濃度IC50表示)，二為胚胎毒性(用半數(shù)抑制分化濃度ID50表示)［6］。通過(guò)檢測(cè)受試物對(duì)ESC分化的影響(即ID50ESC)和對(duì)ESC與成纖維細(xì)胞BALB/c3T3的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果(即IC50ESC和IC503T3)，按照ECVAM推薦的胚胎發(fā)育毒性評(píng)價(jià)公式計(jì)算，即可直接定性某一藥物的可能胚胎毒性［5］。ECVAM用EST對(duì)多種化合物檢測(cè)所得無(wú)胚胎毒性、低胚胎毒性和高胚胎毒性結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)的符合率分別為70%、82.5%和81.25%。并且在大約360種受試物中挑選出具有明確體內(nèi)胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的30種，使用EST進(jìn)行胚胎發(fā)育毒性檢測(cè)，結(jié)果顯示與體內(nèi)結(jié)論的符合率達(dá)到82%，其中強(qiáng)胚胎毒性的符合率更達(dá)到100%［7］。

生長(zhǎng)因子類，包括 aFGF、bFGF、EGF、NGF 等，是體內(nèi)廣泛存在的具有促進(jìn)組織分裂增殖作用的一大類生物因子。目前應(yīng)用基因工程技術(shù)使得這些生長(zhǎng)因子可大量生產(chǎn)成藥物用于臨床。但該類因子在較大劑量和較長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用是否具有某些潛在的毒性一直是人們爭(zhēng)論的問(wèn)題。如鄭海英等［8］研究發(fā)現(xiàn)，添加一定量表皮生長(zhǎng)因子EGF有助于減少胚胎細(xì)胞凋亡和壞死數(shù)目，但當(dāng)EGF濃度達(dá)0.1 mg·L－1時(shí)，它不僅抑制了胚胎的正常發(fā)育，還增加了胚胎細(xì)胞凋亡和壞死率，并對(duì)胚胎細(xì)胞產(chǎn)生損傷和毒害作用;Tichelaar等［9］發(fā)現(xiàn)FGF-7在鼠肺上皮的過(guò)高表達(dá)又可引起胚胎期鼠肺上皮的異常發(fā)育，其組織學(xué)改變類似肺囊腺瘤，正常的肺泡結(jié)構(gòu)消失，最終導(dǎo)致胚胎期小鼠死亡;喻靜等［10］用大鼠原代睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行aFGF生殖毒性研究，當(dāng)培養(yǎng)液中aFGF達(dá)到較高濃度時(shí)，可誘發(fā)細(xì)胞衰老、引發(fā)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變、與細(xì)胞損傷相關(guān)的c-fos、c-jun和c-myb基因表達(dá)也明顯增加。除此之外，還有為避免野生型生長(zhǎng)因子可能存在的毒性而對(duì)其進(jìn)行改構(gòu)的研究［11－12］。因此，該類藥物的生物學(xué)效應(yīng)即促細(xì)胞增殖和分化作用，是否在大劑量使用時(shí)會(huì)引起胚胎發(fā)育毒性及致畸性，值得關(guān)注。

已有報(bào)道外源性aFGF可抑制ESC向骨骼細(xì)胞的定向分化而促使ESC向心肌細(xì)胞的定向分化，而bFGF卻促進(jìn)ESC向骨骼肌細(xì)胞的分化［13］。當(dāng)某一FGF大劑量單獨(dú)使用時(shí)對(duì)組織分化是否會(huì)有異常影響或不平衡分化，未見(jiàn)報(bào)道。而誘導(dǎo)分化的不均衡可能會(huì)帶來(lái)胚胎先天異常的發(fā)生［14］。本實(shí)驗(yàn)室采用未分化基因Sox-2作為指標(biāo)進(jìn)行藥物毒性的評(píng)價(jià)已得到有效性的驗(yàn)證［4］，因此本文用EST模型，按照ECVAM推薦的體外胚胎發(fā)育毒性評(píng)價(jià)方法，采用未分化基因Sox-2表達(dá)量作為衡量分化程度的指標(biāo)，對(duì)bFGF的胚胎毒性進(jìn)行了檢測(cè)和判斷。結(jié)果表明bFGF具有弱胚胎毒性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，當(dāng)bFGF的作用濃度高于30 mg·L－1時(shí)3T3和ESC的形態(tài)均有明顯的變化，可見(jiàn)細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞中出現(xiàn)空泡并有所萎縮，并隨著作用濃度的提高，細(xì)胞幾乎全崩解成黑色碎片。ESC三步法培養(yǎng)結(jié)果顯示，bFGF低劑量組比未加藥組和高劑量組出現(xiàn)心肌搏動(dòng)的時(shí)間要早，可能bFGF在低濃度下促進(jìn)了ESC向心肌細(xì)胞方向分化，而高劑量bFGF的促分化作用消失甚至出現(xiàn)毒性。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)bFGF作用濃度大于50 mg·L－1時(shí)無(wú)法形成完整的擬胚體。

總之，本實(shí)驗(yàn)按照ECVAM推薦的體外胚胎發(fā)育毒性評(píng)價(jià)方法對(duì)bFGF進(jìn)行了初步的發(fā)育毒性評(píng)價(jià)，結(jié)論是bFGF具有弱胚胎毒性。而不同濃度bFGF作用ESC在發(fā)育過(guò)程中內(nèi)、中、外三胚層的各個(gè)基因以及蛋白的變化還需要進(jìn)一步研究，從而更全面的了解bFGF在整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)不同胚層發(fā)育的影響，以期為臨床用藥提供參考。

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