APPβ分泌酶切割位點(diǎn)特異性單鏈抗體的制備和鑒定

黃 巍，周麗榮，周 婷，孫紅霞，黃曉剛，劉 橋

(武漢市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室，湖北武漢 430014)

阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中 β-淀粉樣蛋白(amyloid β protein，Aβ)胞內(nèi)外異常過量產(chǎn)生、聚集和沉積，是導(dǎo)致AD老年斑形成和神經(jīng)元毒性的確切病理現(xiàn)象和重要誘因。Aβ由I型跨膜的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)分泌酶水解代謝產(chǎn)生，按作用位點(diǎn)可分為α、β和γ 3種，α和β分泌酶(β-site APP-cleaving enzyme，BACE)先競爭性的水解 APP，然后γ分泌酶再水解剩下的APP片段產(chǎn)生各自代謝產(chǎn)物。Aβ由β和γ分泌酶依次水解APP產(chǎn)生［1］，具有毒性;α和γ分泌酶依次水解APP，產(chǎn)生的可溶性sAPPα肽和P3肽段則具有神經(jīng)營養(yǎng)等作用。若APP的α和β代謝失去平衡，產(chǎn)生過多的Aβ，就容易誘發(fā)AD。

APPβ分泌酶切割位點(diǎn)是Aβ產(chǎn)生的關(guān)鍵位點(diǎn)，容易受到周圍空間環(huán)境影響，如將Aβ抗體與APP結(jié)合，當(dāng)抗體識別位點(diǎn)靠近Aβ的N端，即靠近APP的β切割位點(diǎn)，則Aβ的產(chǎn)生會受到干擾［2］，抗體識別位點(diǎn)正好為APPβ分泌酶切割位點(diǎn)序列時則作用更直接［3-4］，提示APPβ位點(diǎn)可以作為一個藥物設(shè)計的良好靶點(diǎn)。我們在研制抗人APPβ分泌酶水解位點(diǎn)的單克隆抗體(mAb)的基礎(chǔ)上［5］，進(jìn)一步研制特異性單鏈抗體(ScFv)，ScFv相對mAb具有免疫原性弱，組織穿透力強(qiáng)，更容易通過血腦屏障等特點(diǎn)。APPβ分泌酶切割位點(diǎn)抗體與Aβ抗體在識別序列和減低Aβ機(jī)制上都有所不同，前者的目的是阻礙β分泌酶進(jìn)入作用位點(diǎn)，切割A(yù)PP產(chǎn)生Aβ，后者則是激活免疫系統(tǒng)，溶解清除已產(chǎn)生的Aβ，見Fig 1。

Fig 1 The delineation of APP degradation

1 材料與方法

1.1 材料 分泌抗人APPβ分泌酶水解位點(diǎn)單克隆抗體細(xì)胞株1A7和2H10［5］，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hAPP751(+4G)的 CHO細(xì)胞株(過表達(dá)人APP751和GFP融合蛋白)［6］由本室制備保存。限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I、pMD19-T克隆載體和逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV等為大連寶生物公司產(chǎn)品。引物合成與測序?yàn)樯虾ＳⅡE生物技術(shù)公司，高保真pfu酶和細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，鎳NTA Resin為上海博彩生物科技有限公司產(chǎn)品，增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒為北京天根生化公司產(chǎn)品。APPβ位點(diǎn)序列多抗原短肽［ISEVKMDA］8由上海波泰生物科技公司合成，抗His的單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，抗His的兔多克隆抗體和Aβ肽(1-42)為北京博奧森生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 由于含linker序列的引物不利于擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL基因，故先設(shè)計不含linker序列的引物擴(kuò)增抗體的VH和VL片段，再以此為模板用含linker序列的引物擴(kuò)增VH和VL，引物分別為:VHF(重鏈VH上游引物):5'-ATAGGATCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'(含 BamH I位點(diǎn);W=A/T，S=G/C，M=A/C，R=A/G);VHB1(重鏈 VH下游引物，不含 linker序列):5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3';VHB(重鏈 VH下游引物，含 linker序列):5'-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3';VLF1(輕鏈 VL上游引物，不含 linker序列):5'-GACATCGAGCTCACCCAGTCTC-3';VLF(輕鏈VL上游引物，含linker序列):5'-CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACCCAGTCTC-3';VLB(輕鏈VL下游引物):5'-CGCGAATTCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTCCC-3'(含EcoR I位點(diǎn))。引物VHB1和VLF1分別是VHB和 VLF中3'端序列的一部分，VHB和VLF中5'端部分為含有互補(bǔ)關(guān)系的linker序列，VHF和VLB分別含有BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，便于拼接出來的ScFv構(gòu)建載體。

1.2.2 VH和VL基因的克隆 分別提取1A7和2H10總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以 cDNA為模版，分別用VHF/VHB1和VLF1/VLB引物擴(kuò)增出不帶linker的序列，命名為VH1和VL1，回收純化VH1和VL1片段，再以此為模板，用VHF/VHB和VLF/VLB引物，在高保真pfu酶作用下，分別擴(kuò)增含linker序列的VH和VL片段。

1.2.3 ScFv的拼接 將VH和VL片段回收純化，通過重疊延伸PCR(splicing by overlapping extension PCR，SOE-PCR)技術(shù)連接起來，即為ScFv片段，其主要過程如下:取等量純化后的VH和VL片段與適量dNTP和Taq酶混勻，進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為:94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃1 min，共進(jìn)行 7 個循環(huán)。然后，不必純化直接取適量SOE-PCR反應(yīng)液作為模板，用VHF/VLB引物大量擴(kuò)增 ScFv片段。將PCR的產(chǎn)物與 pMD19-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，挑選陽性克隆測序。

1.2.4 ScFv表達(dá)載體的構(gòu)建 以測序正確的ScFv克隆載體為模板，用VHF/VLB引物再次大量擴(kuò)增ScFv片段，BamH I和EcoR I雙酶切，回收純化后與同樣雙酶切的pET-28a表達(dá)載體相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，通過PCR、BamH I和 EcoR I雙酶切和測序鑒定陽性克隆，命名為pET-ScFv(APPβ)。

1.2.5 ScFv的表達(dá)純化及鑒定 將鑒定正確的pET-ScFv(APPβ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，篩選陽性菌落進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎離心收集上清和沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析。結(jié)果表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式居多，目的蛋白帶有his標(biāo)簽，通過鎳柱純化和復(fù)性，Western blot檢測，一抗為抗His的單克隆抗體，增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色。

1.2.6 可溶性ScFv生物活性的分析 通過ELISA分別檢測ScFv對人APPβ分泌酶位點(diǎn)序列短肽的結(jié)合能力和對Aβ的交叉反應(yīng):以APPβ位點(diǎn)序列多抗原短肽［ISEVKMDA］8或 Aβ(1-42)包被酶標(biāo)板，5 mg·L-1，每孔 100 μl，4℃過夜。洗板后，加可溶性ScFv，然后依次加抗His的兔多克隆抗體、HRP標(biāo)記抗兔二抗，TMB顯色并讀取A450值。通過Western blot檢測ScFv對人全長APP的結(jié)合能力:培養(yǎng)過表達(dá)人APP751和GFP融合蛋白的CHO細(xì)胞和過表達(dá)GFP的CHO細(xì)胞，裂解后行10%SDSPAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，可溶性ScFv 4℃孵育過夜，洗膜后加抗His的單克隆抗體37℃ 2 h，洗膜，再加HRP酶標(biāo)二抗37℃2 h，試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 VH和 VL基因的克隆及 ScFv的拼接 從2H10中擴(kuò)增出預(yù)期的約370 bp的VH1和330 bp的VL1條帶，回收純化后以各自為模板，分別擴(kuò)增出含linker序列的大小分別約為410 bp和380 bp的VH和VL條帶。將VH和VL回收純化，經(jīng)SOE-PCR拼接得到約750 bp的ScFv片段，見Fig 2。將2H10的ScFv與pMD19-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，挑選陽性克隆測序，測序正確的序列用于ScFv表達(dá)載體的構(gòu)建。從1A7中沒有擴(kuò)增出預(yù)期的VH1，該株克隆中止。

2.2 表達(dá)載體pET-ScFv(APPβ)的構(gòu)建和鑒定經(jīng)篩選得到的陽性重組體命名為pET-ScFv(APPβ)，通過PCR可以擴(kuò)增出約750 bp的條帶，BamH I和EcoR I雙酶切顯示兩個片段，分別是約5.5 kb和750 bp，與預(yù)計結(jié)果相同，見Fig 3。測序分析表明ScFv序列全長744 bp，編碼248個氨基酸，輕重鏈基因序列符合小鼠抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，表達(dá)載體閱讀框正確，見Fig 4。

Fig 2 PCR product of VL1，VH1，VL，VHand ScFv gene from hybridoma 2H10

Fig 3 PCR product and the results of reconstruction vector pET-ScFv(APPβ)digested by BamH I and EcoR I

2.3 ScFv的表達(dá)純化和鑒定 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12%SDS-PAGE分析，在約29 ku位置處出現(xiàn)新增條帶。誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)超聲破碎離心收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要為包涵體形式。通過鎳柱純化并復(fù)性后，可得到分子量約29 ku、純度在90%以上的條帶。目的蛋白通過his標(biāo)簽進(jìn)行Western

blot檢測，結(jié)果顯示在分子量大小為29 ku處有特異條帶，與預(yù)期ScFv蛋白情況相符，見Fig 5。

2.4 可溶性ScFv生物活性的分析 ELISA檢測結(jié)果表明，分別包被APPβ位點(diǎn)序列多抗原短肽［ISEVKMDA］8和Aβ，ScFv能夠與前者結(jié)合，與 Aβ 的結(jié)合反應(yīng)則未能檢測到。過表達(dá)人APP751和GFP融合蛋白的CHO細(xì)胞和過表達(dá)GFP的CHO細(xì)胞，裂解后行10%SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜，封閉后，依次加可溶性ScFv、抗His單克隆抗體和酶標(biāo)二抗孵育，增強(qiáng)型HRP-DAB顯色。結(jié)果過表達(dá)APP細(xì)胞在約156 ku的地方出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的全長APP(約130 ku)+GFP標(biāo)簽(約26 ku)分子量之和一致，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 GFP的細(xì)胞無任何條帶，排除ScFv與GFP結(jié)合的可能，表明ScFv是可以與全長APP結(jié)合的，見Fig 6。

3 討論

目前，有關(guān)阻斷或清除胞內(nèi)外異常增多Aβ的研究主要集中在APPβ及γ分泌酶抑制劑或RNA干擾［7-9］、Aβ抗體或疫苗等方向，但存在一些問題，如APP分泌酶除APP外，還有其它在正常生理活動中發(fā)揮重要功能的底物，抑制分泌酶活性有可能帶來嚴(yán)重的副作用。APPβ分泌酶切割位點(diǎn)抗體為減少Aβ提供新的思路，當(dāng)其與作用位點(diǎn)結(jié)合后，發(fā)揮空間位阻效應(yīng)，阻礙β-分泌酶進(jìn)入位點(diǎn)，致使Aβ無法產(chǎn)生，此方法通過阻礙水解酶進(jìn)入特定位點(diǎn)而抑制其特定作用，由于不直接抑制水解酶的活性，特異性高副作用小，可為AD或其他新型藥物設(shè)計或疫苗研究提供借鑒。

Aβ的產(chǎn)生有兩大途徑——分泌途徑和內(nèi)吞途徑，β-分泌酶和位于高爾基體、細(xì)胞表面和內(nèi)吞體等處的APP均能相互作用，在APP的分泌過程和胞膜APP內(nèi)吞體形成與循環(huán)過程中水解APP生成Aβ［10-11］。APPβ 分泌酶位點(diǎn)單克隆抗體主要在內(nèi)吞體循環(huán)過程中抑制Aβ產(chǎn)生，抑制率約50%［12］。本文進(jìn)一步研制APPβ分泌酶位點(diǎn)小分子的ScFv，期望以后通過基因轉(zhuǎn)染等方式將其導(dǎo)入胞內(nèi)，還可在APP的分泌過程中抑制Aβ產(chǎn)生。本文制備的ScFv在抑制Aβ產(chǎn)生的同時還可能具有促進(jìn)APPα代謝的潛能。雖然有報道指出APPβ位點(diǎn)單克隆抗體不能在阻斷BACE作用的同時使APP朝α代謝途徑發(fā)展［3］，但小分子的單鏈抗體或胞內(nèi)抗體則不然，不但不會影響α位點(diǎn)水解，還有利于APP與α酶結(jié)合使其向α分泌途徑發(fā)展。這是因?yàn)锳PP的α和β位點(diǎn)距離很近，α酶和β酶(或β位抗體)與相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合時可能出現(xiàn)類似競爭性結(jié)合的情況。當(dāng)β酶或β位單克隆抗體與β位點(diǎn)結(jié)合后，由于兩者分子較大都會阻礙α酶與α位點(diǎn)的結(jié)合，故影響APP的α代謝;而小分子抗體由于空間位阻小，與β位點(diǎn)結(jié)合后既阻礙β酶進(jìn)入β位點(diǎn)又方便α酶與α位點(diǎn)的結(jié)合，從而有利于APP的α代謝。關(guān)于這一點(diǎn)，識別位點(diǎn)靠近β位的抗Aβ胞內(nèi)抗體的研究提供了有力的證據(jù)［2］，研究表明該Aβ抗體對α位點(diǎn)的水解有促進(jìn)作用，因此，可以推斷距離α位點(diǎn)較該Aβ抗體更遠(yuǎn)的β位點(diǎn)單鏈抗體或胞內(nèi)抗體，對APPα分泌酶與α位點(diǎn)結(jié)合切割過程將會更有利。

Fig 4 The sequence of pET-ScFv(APPβ)

Fig 5 SDS-PAGE analysis and Western blot assay of pET-ScFv(APPβ)

Fig 6 Western blot analysis of the binding of soluble ScFv to the full length of hAPP

本文采用的是傳統(tǒng)克隆抗體可變區(qū)的方法，即用一組簡并引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果兩株雜交瘤細(xì)胞中只有2H10可以擴(kuò)增出VH和VL基因并成功拼接出ScFv序列，而1A7擴(kuò)增不出預(yù)期大小的VH(簡并引物擴(kuò)增VH時，有一條約700 bp的帶，資料未顯示)，說明抗體可變區(qū)高度可變，簡并引物法不適用于某些抗體可變區(qū)序列的擴(kuò)增，需要采用其他方法釣取抗體的可變區(qū)序列。在擴(kuò)增VH和VL基因片段時，不宜直接使用含linker序列的引物VHB和VLF，否則由于引物太長導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜不利于片段擴(kuò)增，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或效率過低不利于回收。本文先用不含linker序列的短引物VHB1和VLF1與各自配對引物擴(kuò)增出目的片段VH1和VL1，經(jīng)純化后再各自為模板，用含linker序列的引物擴(kuò)增相應(yīng)的VH和VL片段，效果很好。用于擴(kuò)增VH和VL的模板VH1和VL1必須要純化，否則不利于VH和VL的擴(kuò)增;而SOEPCR產(chǎn)物應(yīng)直接用于PCR擴(kuò)增ScFv序列，可以擴(kuò)增出很亮的ScFv帶，若純化后再擴(kuò)增ScFv，則容易出現(xiàn)帶拖尾不集中等情況。ScFv與pET-28a表達(dá)載體相連接并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，載體上His標(biāo)簽與ScFv融合，方便ScFv通過鎳柱純化和復(fù)性。ELISA和Western blot檢測結(jié)果表明，可溶性ScFv與人APPβ分泌酶水解位點(diǎn)序列短肽和全長APP都有結(jié)合活性，對Aβ沒有交叉反應(yīng)，可以推斷ScFv能夠與全長APP的β分泌酶切割位點(diǎn)結(jié)合，這為進(jìn)一步研究ScFv干預(yù)分泌酶對APP的水解過程奠定了基礎(chǔ)。

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