腫瘤自噬效應(yīng)及其在非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療中的潛在應(yīng)用

陳美娟，詹 瑧，張 旭，2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科，2.江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)約占肺癌的80%。目前臨床上常用的手術(shù)、放化療等治療手段其療效仍然相當(dāng)不足，臨床治療失敗的主要原因是復(fù)發(fā)和發(fā)生重要器官的轉(zhuǎn)移，因此，迫切需要尋找其它治療手段以彌補(bǔ)目前治療的不足。

1 NSCLC分子靶向治療的主要方向及存在問題

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和對癌癥發(fā)生機(jī)制的深入研究，以特定分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物逐漸受到關(guān)注。例如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，由于其在多種上皮腫瘤中均過度表達(dá)，而且在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、修復(fù)和生存及新生血管的生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用，因此成為抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)之一。由于大多數(shù)NSCLC都表達(dá)EGFR及其天然配體，目前發(fā)現(xiàn)約62%的鱗癌和腺癌中存在EGFR的過度表達(dá)［1］，并且EGFR的活化可進(jìn)一步激活對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都起關(guān)鍵作用的Ras/MAPK、PI3K/Akt和 JAK/STATs等3 條信號通路［2］，因此針對EGFR的分子靶向治療成為NSCLC臨床中治療的一個(gè)重要方向。以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)和以西妥昔(cetuximab)為代表的EGFR單克隆抗體已應(yīng)用于NSCLC的臨床治療，并且顯示出了一定的療效，但隨著天然或獲得性抵抗的發(fā)生，其療效會大大降低。據(jù)最新報(bào)道，這些藥物產(chǎn)生臨床耐藥性某種程度上和它們誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬(autophagy)作用有關(guān)［3－4］。

2 自噬在腫瘤治療中的雙重作用

自噬是溶酶體對細(xì)胞內(nèi)的部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等進(jìn)行一系列降解過程的統(tǒng)稱。其形態(tài)學(xué)的最主要特征是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量具有雙層膜的內(nèi)部存在胞質(zhì)及細(xì)胞器的吞噬泡。自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有雙重的作用。在某些情況下自噬可能成為保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受損傷的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，如當(dāng)腫瘤細(xì)胞缺乏營養(yǎng)供應(yīng)時(shí)，尤其在腫瘤的中心地帶，細(xì)胞內(nèi)自噬作用會增加，通過降解蛋白質(zhì)和細(xì)胞器可以給其他腫瘤細(xì)胞供應(yīng)氨基酸、脂肪酸和核苷酸等營養(yǎng)物質(zhì)以提高其生存的機(jī)會和侵襲的能力［5］。因此，在某些情況下抑制自噬可以增加藥物的抗癌作用。如Wu等［6］發(fā)現(xiàn)在人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，抑制自噬會明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞在營養(yǎng)被剝奪狀況下的生存能力，而通過過表達(dá)真核延長因子-2激酶(eEF-2K)提高自噬水平，可以提高腫瘤細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏狀況下的生存能力，并且發(fā)現(xiàn)mTOR通路參與eEF-2K對自噬的調(diào)節(jié)。Amaravadi等［7］給動物接種缺少核p53基因從而能抵抗凋亡的腫瘤細(xì)胞造成淋巴瘤動物模型，發(fā)現(xiàn)動物整體水平通過它莫西芬誘導(dǎo)激活p53后，腫瘤先衰退，然后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p53的激活很快伴隨凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，但在存活的細(xì)胞中產(chǎn)生了自噬。而通過氯喹或針對Atg5進(jìn)行shRNA干擾抑制自噬，會提高腫瘤細(xì)胞p53激活的水平和烷化劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的能力。Carew等［8］也發(fā)現(xiàn)，通過氯喹阻斷自噬，可以提高組蛋白脫乙酰酶抑制劑——SAHA誘導(dǎo)的過氧化物的產(chǎn)生水平，促進(jìn)其重新定位，并明顯增加其在溶酶體蛋白酶內(nèi)的含量，減少其底物硫氧還蛋白的表達(dá)，從而提高其抗癌活性。另外，在某些放化療治療中，自噬也成為腫瘤細(xì)胞逃避損傷的機(jī)制［9－10］。

與上述自噬保護(hù)腫瘤細(xì)胞的情況相反，許多研究發(fā)現(xiàn)自噬也可以在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。因?yàn)樽允煽梢酝ㄟ^清除受損細(xì)胞器，避免有害自由基及突變的發(fā)生，從而避免更大范圍的損傷;還可以限制DNA損傷，維持基因組完整性;另外還能抑制細(xì)胞生長，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡式程序性死亡。如Scott等［11］發(fā)現(xiàn)，Atg1高表達(dá)所誘導(dǎo)的自噬可使腫瘤細(xì)胞明顯縮小，從而控制其生長。同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡，這種細(xì)胞死亡具有明顯的凋亡特征。在其他的療法或藥物抗腫瘤的過程中，也發(fā)現(xiàn)自噬過程發(fā)揮了積極作用，物理療法如Kessel等［12］報(bào)道的光動力療法;抗癌藥物如烷化劑——替莫唑胺(temozolomide)、順鉑;mTOR抑制劑——rapamycin、temsirolimus、everolimus;天然藥物——伴刀豆球蛋白A(Con A)、姜黃素、染料木黃酮(genistein)、維生素 D 類似物;NF-κB 抑制劑——BAY11-7082，Parthenolide;植物生物堿——紫杉醇、長春堿;甚至還有其他一些化合物如 As2O3、糖皮質(zhì)激素、Nelfinavir等［13］。

3 自噬效應(yīng)在非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療中的潛在應(yīng)用

在NSCLC臨床常用藥物gefitinib和erlotinib抗藥性產(chǎn)生機(jī)制的研究中，Han等［3］發(fā)現(xiàn)，gefitinib和erlotinib可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞A549和H1299發(fā)生較高水平的自噬，甚至在用siRNAs干擾降低EGFR的表達(dá)后，gefitinib、erlotinib依然能誘導(dǎo)自噬。而當(dāng)用自噬抑制劑氯喹(chloroquine，CQ)或用siRNAs對自噬相關(guān)基因Atg5和Atg7進(jìn)行干擾后，則會明顯增加gefitinib和erlotinib的細(xì)胞毒性。另外，Li等［4］也報(bào)道，西妥昔單抗的臨床抗藥性的產(chǎn)生也和其誘導(dǎo)自噬相關(guān)，其主要也是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬，細(xì)胞自噬的同時(shí)還伴隨HIF-1α和Bcl-2水平的降低。用PI3K-Ⅲ抑制劑3-MA可以抑制西妥昔單抗誘導(dǎo)的自噬，而敲除自噬調(diào)節(jié)基因beclin1或Atg7，或用溶酶體抑制劑氯喹處理細(xì)胞會增加西妥昔單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

由此表明自噬作用在NSCLC的臨床治療中同樣是一個(gè)不可忽略的重要環(huán)節(jié)，在NSCLC治療的各個(gè)階段都應(yīng)考慮到自噬作用的影響。

在腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬可表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用，因此在肺癌的早期診斷和治療中，應(yīng)將自噬相關(guān)基因beclin1、p53等納入肺癌的臨床分型指標(biāo)體系。其中，beclin1是自噬最主要的正調(diào)節(jié)因子，在多種人類癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)beclin1的缺失［14］。此外，值得重視的是對自噬具有雙重調(diào)節(jié)能力的抑癌基因p53。在正常情況下p53為野生型(wt p53)，而在大部分癌細(xì)胞包括肺癌細(xì)胞中，p53表現(xiàn)為突變型(mt p53)［15］。在NSCLC中，p53突變的比例約占50%，而且其發(fā)生水平在鱗癌中相對最高，在腺癌中較低［16－19］。p53對自噬的雙重調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在:在細(xì)胞核中，p53作為核轉(zhuǎn)錄因子，通過與 AMPK、DAPK-1、DRAM(damage-regulated autophagy modulator)、Bad、Bax、BNIP3、PUMA、Sestrin1/2和TSC2等自噬調(diào)節(jié)分子的基因啟動子區(qū)結(jié)合，可以促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)自噬;而在細(xì)胞質(zhì)中，p53不依賴于其核轉(zhuǎn)錄因子的角色，而主要是通過激活mTORC1，抑制自噬。而且，在營養(yǎng)缺乏或缺氧的情況下，增加的自噬可能促成p53缺失的癌細(xì)胞的生存［20］。

由于在腫瘤發(fā)展的后期，自噬可能對腫瘤的進(jìn)展起促進(jìn)作用，如處于腫瘤組織中心部位的腫瘤細(xì)胞可以通過自噬在低氧供應(yīng)和低營養(yǎng)狀態(tài)下獲得生存;另外，自噬還可通過封閉凋亡通路以保護(hù)某些腫瘤細(xì)胞的抗癌治療。在該類情況下，則應(yīng)該抑制自噬、激活凋亡，從而讓腫瘤細(xì)胞對治療手段變得敏感。

另外，還可以有針對性地探索一些單純誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自吞噬式細(xì)胞死亡(即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡)的藥物和治療手段。尋找該類藥物的方向主要從調(diào)控自噬的相關(guān)信號通路和相關(guān)分子靶標(biāo)入手。目前發(fā)現(xiàn)正向調(diào)節(jié)自噬的信號通路或相關(guān)分子主要有:Ras/Raf1/ERK1/2、ClassⅢPI3K/Beclin1、TRAIL-R(TNF-related apoptosis-inducing factor)/TNF-R/FADD(Fas-associated death domain protein)，LKB1/AMPK、JNK、DAPK(death-associated protein kinase)，DRP-1(death-associated related protein kinase-1);負(fù)向調(diào)節(jié)自噬的信號通路主要有:ClassIPI3K/AKT/mTOR/p70s6k、p38MAPK等(Fig 1)［21］。

其中，在負(fù)向調(diào)節(jié)自噬的信號通路中，mTOR是最主要的信號分子。mTOR是哺乳動物雷帕霉素的靶點(diǎn)，其對細(xì)胞的生長、增殖、存活都具有重要的調(diào)節(jié)作用。mTOR既可以與 Raptor、mLST8和 PRAS40組成 mTOR復(fù) 合 體 1(mTORC1)，也可以和 Rictor、mSIN1和 Protor-1組成 mTOR復(fù)合體2(mTORC2)，其中只有mTORC1對雷帕霉素敏感。

在mTORC1的上游，調(diào)節(jié)mTORC1的信號通路主要有3條:即 ClassIPI3K/AKT、Ras/Raf1/ERK1/2和 LKB1/AMPK。其中前兩條通路激活 mTORC1，最后一條通路抑制mTORC1。PI3K/Akt對mTOR的激活一是通過抑制TSC1/TSC2復(fù)合體來激活 Rheb，從而激活 mTORC1［22］;二是通過磷酸化激活mTORC1的結(jié)合蛋白PRAS40，使其與mTORC1解離，同時(shí)結(jié)合 14-3-3蛋白，從而 mTORC1被激活［23］。LKB1(絲氨酸/蘇氨酸激酶11)下調(diào)mTORC1主要是在細(xì)胞遇到能量短缺壓力時(shí)，被PARP-1［poly(ADP-ribose)polymerase-1］激活的 LKB1首先將 AMPK磷酸化，然后活化的AMPK將TSC2磷酸化激活，活化的TSC2再激活 Rheb的GAP，從而抑制 mTORC1［24］。

Fig 1 Diagram of autophagy signaling

在mTORC1的下游，mTORC1也通過3條途徑影響自噬:其一，通過阻止哺乳動物自噬相關(guān)蛋白13(mAtg13)和ULK的結(jié)合，導(dǎo)致 ULK穩(wěn)定性下降，使依賴于 ULK的FIP200的磷酸化被抑制，從而誘導(dǎo)自噬;其二，通過促進(jìn)4EBP1的磷酸化，利于其與真核翻譯起始因子4E(eIF4E)解離，從而上調(diào)cap依賴的翻譯過程，抑制自噬;其三，真核延長因子2(eEF2)可以促進(jìn)肽鏈延長，但eEF2激酶(eEF2K)可磷酸化eEF2并使其失活，從而抑制肽鏈延長。但磷酸化的p70s6k可以磷酸化eEF2K，使上述活性失效，從而促進(jìn)翻譯。因此mTORC1通過磷酸化p70s6k，促進(jìn)翻譯，抑制自噬［25］。

4 結(jié)語

總之，在NSCLC的臨床治療中，應(yīng)充分考慮并利用好自噬效應(yīng)，適當(dāng)情況下，可以將其作為NSCLC分子靶向治療的方向之一，從而一方面使各種治療手段的臨床療效得以提高，另一方面結(jié)合自噬相關(guān)信號通路，開發(fā)出新的靶標(biāo)治療藥物，使得它們共同為NSCLC的臨床治療更有效地發(fā)揮作用。

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