HPLC法測(cè)定3種雜交翠菊花色苷的含量

陳亮，李公斌，辛秀蘭，袁其朋

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029；2.淄博職業(yè)學(xué)院，山東 淄博 255314；3.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100029）

HPLC法測(cè)定3種雜交翠菊花色苷的含量

陳亮1，3，李公斌2，辛秀蘭3，袁其朋1，*

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029；2.淄博職業(yè)學(xué)院，山東 淄博 255314；3.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100029）

采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)3種不同顏色的雜交翠菊花色苷含量進(jìn)行測(cè)定。使用1%鹽酸甲醇溶液分別對(duì)3種不同顏色翠菊花色苷進(jìn)行提取,以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為對(duì)照品,使用Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-5%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm。結(jié)果表明，粉紅色、紫紅色、藍(lán)紫色3種雜交翠菊花色苷含量分別為168.15、614.89、193.89 mg/100 g，紫紅色雜交翠菊具有較好的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。

翠菊；花色苷；高效液相色譜法

翠菊[Callistephus chinensis（Linn.）Nees]屬于菊科（Compositae）翠菊屬（Callistephus）的單型種，一年生草本植物、淺根性、莖直立、多分枝、葉互生、頭狀花序、舌狀花。生長(zhǎng)于山坡拋荒地、山坡草叢、水邊或疏林蔭處。主產(chǎn)于我國(guó)吉林、遼寧、河北、山西、山東、云南及四川等省。翠菊是重要的露地綠化用花卉，同時(shí)也是重要的盆栽觀賞花卉[1]。

翠菊色彩豐富艷麗，有紫紅、桃紅、藍(lán)紫等色,尤其是2000年劉振廷先生發(fā)現(xiàn)翠菊雄性不育株，并在世界上首先培育出翠菊的雜交品種，翠菊的顏色愈發(fā)的多樣化，且易于人工控制，為翠菊市場(chǎng)的開拓與發(fā)展提供了有效的途徑。同時(shí)，花色的不同，其所含的天然水溶性色素花色苷成分的種類和含量亦有很大的不同，目前天然食用色素因其良好的安全性、天然著色效果以及抗氧化、抗衰老、抗突變等優(yōu)良生理活性[2-3]，頗受人們青睞，而人工合成色素日益暴露出諸多弊病，因此，研究開發(fā)翠菊花色苷具有很重要的發(fā)展應(yīng)用前景。

目前，測(cè)定花色苷的含量主要有pH示差法、直接測(cè)定法和HPLC法，pH示差法是傳統(tǒng)的、經(jīng)典的、無需對(duì)照品的測(cè)定方法。而直接測(cè)定法和HPLC法需要對(duì)照品，且對(duì)照品不易獲得、較為昂貴，一度限制了方法的廣泛應(yīng)用，但是HPLC法可以獲得更多的樣品信息，除了可以測(cè)定總的花色苷含量，還可根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)推斷花色苷種類的數(shù)量以及相對(duì)含量，能夠更為直觀、快速、簡(jiǎn)便的了解樣品，同時(shí)也為翠菊品種的質(zhì)量控制（如：采收期、品種、儲(chǔ)藏、加工等）提供了有效的借鑒[4-6]。

對(duì)3種不同顏色雜交翠菊花色苷的提取及測(cè)定進(jìn)行了研究，為其開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

Agilent-1100高效液相色譜儀（DAD）：美國(guó)安捷倫公司；冷凍高速離心機(jī)：Sigma 3K15；HZQ-Q振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 主要材料

新鮮盛花期雜交翠菊（Callistephus chinensis表觀顏色：Ⅰ粉紅色；Ⅱ紫紅色；Ⅲ藍(lán)紫色）：湖北富程生物技術(shù)有限公司提供；花色苷對(duì)照品（矢車菊-3-O-葡萄糖苷，純度>98%）：成都曼思特生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：ZorbaxSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：溶劑A為甲醇；溶劑B為5%甲酸水溶液；梯度洗脫條件：0～10 min，5%～24%甲醇（A）；10 min～15 min，24%；15 min～30 min，24%～35%；30 min～35 min，35%；35 min～50 min，35%～50%；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm；掃描波長(zhǎng)：260 nm～600 nm；柱溫30℃。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及線性關(guān)系考察

精確稱取矢車菊-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品10 mg溶于10 mL 1%鹽酸甲醇溶液，進(jìn)樣0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μL，各重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算3次平均峰面積。將峰面積Y與進(jìn)樣量X進(jìn)行直線回歸分析，對(duì)照品在0～6.4 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=1561.1X-7.3，相關(guān)系數(shù) R2=0.9998，見圖 1。

圖1 對(duì)照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of the standard(cyn-3-O-glu)

2.3 樣品的制備

稱取3種不同顏色樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，搗碎，分別溶于1%（體積比）HCl甲醇溶液中，振蕩器低速低溫振蕩提取2 h，靜置過夜，7000 r/min高速離心10 min，殘?jiān)倭砑犹崛∪軇?，振蕩浸提離心洗滌至無色，合并3次上清液，分別定容至25 mL，備用。

2.4 精密度試驗(yàn)

吸取一定量矢車菊-3-O-葡萄糖苷溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。測(cè)得RSD為1.27%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取一定量矢車菊-3-O-葡萄糖苷溶液，隔4 h進(jìn)樣測(cè)5次，測(cè)定峰面積。測(cè)得RSD為1.46%，表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品花色苷含量的測(cè)定

取1mL提取液，過0.45 μm濾膜后吸取一定量續(xù)濾液進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定并根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算出花色苷的總含量，見表1。

表1 3種不同顏色翠菊花色苷含量Table 1 The anthocyanin content of three hybrid callistephus chinensis with different colors

由測(cè)定峰面積及公式計(jì)算出3種不同顏色翠菊的花色苷含量，此外，通過3次重復(fù)試驗(yàn)，表明試驗(yàn)的重現(xiàn)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

取3種不同顏色樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3份，精密吸取矢車菊-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品溶液1 mL，按照2.3的步驟制樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明：對(duì)照品的平均回收率分別為98.37%、96.85%、99.01%，RSD分別為2.33%、2.26%、2.51%，由此建立了HPLC測(cè)定翠菊花色苷含量的方法，此方法快速、簡(jiǎn)便、可靠。

3 結(jié)論

3.1 HPLC測(cè)定方法的探討

運(yùn)用HPLC法測(cè)定總花色苷的含量應(yīng)注意幾點(diǎn)問題：1.選擇合適的色譜條件，色譜條件應(yīng)最大限度的使各個(gè)色譜峰實(shí)現(xiàn)基線的分離，色譜峰的重疊將導(dǎo)致總花色苷的含量降低；2.選擇合適的色譜柱，一般的色譜柱測(cè)定的pH范圍在2～8，SB-C18色譜柱的pH范圍在1～9，可以有效地避免5%的甲酸水溶液對(duì)色譜柱的損害；3.保證對(duì)照品和供試品的測(cè)定條件相同，如pH、溫度，在不同的pH下，花色苷的最大吸收波長(zhǎng)和峰面積會(huì)發(fā)生變化；4.花色苷提取液經(jīng)過樹脂純化將會(huì)導(dǎo)致花色苷含量不同程度的降低；5.根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算的總花色苷結(jié)果會(huì)有差異。

3.2 雜交翠菊花色苷的研究開發(fā)意義

雜交翠菊生態(tài)適應(yīng)性和傳統(tǒng)翠菊無異，栽培要求條件不高，我國(guó)北方大部分地區(qū)均可種植，其畝產(chǎn)量可達(dá)2000 kg，本文通過對(duì)HPLC測(cè)定發(fā)現(xiàn)紫紅色雜交翠菊花色苷含量較高，為614.89 mg/100 g鮮重，對(duì)開發(fā)高產(chǎn)、高效、高附加值的天然色素具有重要的意義，因此，研究雜交翠菊天然色素具有廣闊的前景和重要的意義。

[1]傅壯.中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書:觀賞園藝卷[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1996:347

[2]Bridle P,Timberlake C F.Anthocyanins as natural food coloursselected aspects[J].Food chemistry,1997,58(2):103-109

[3]Juan Carlos Espin,Cristina Soler-Rivas,Harry J Wichers,et al.Anthocyanin-based natural colorants:A new source of antiradical activity for foodstuff[J].J Agric Food Chem,2000,48(5):1588-1592

[4]Jungmin Lee,Christopher Rennaker,Ronald E Wrolstad.Correlation of two anthocyanin quantification methods:HPLC and spectrophotometric methods[J].Food chemistry,2008,110(3):782-786

[5]Luigi Mondello,Antonella Cotroneo,Giacinto Errante,et al.Determination of anthocyanins in blood orange juices by HPLC analysis[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2000,23(1):191-195

[6]Xianli Wu,Ronald L Prior.Systemaic identification and characterization of anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States:fruits and berries[J].J Agric Food Chem,2005,53(7):2589-2599

Determination of Anthocyanin Content in Hybrid Callistephus Chinensis by HPLC

CHEN Liang1,3,LI Gong-bin2,XIN Xiu-lan3,YUAN Qi-peng1,*
（1.College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China;2.Zibo Vocational College,Zibo 255314,Shandong,China;3.Beijing Vocational College of Electronic Science,Beijing 100029,China）

To determine the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis with different colors.The sample was extracted with methanol of 1%HCl,the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis has been detected by HPLC using cyanidin-3-O-glucoside(cy-3-O-glu)as standard.The analysis was carried on Zorbax SB-C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was methanol-5%formic acidwater at the flow rate of 1 mL/min,the detection wavelength was 520 nm.Results and conclusion were that the anthocyaninscontentsinthreecallistephuschinensiswithpink,purpleandblue-violetcolorswere168.15mg/100g,614.89 mg/100 g and 193.89 mg/100 g,respectively.It was valuable to exploit the hybrid callistephus chinensis with purple color.

hybrid callistephus chinensis;anthocyanin;HPLC

北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教深化計(jì)劃資助項(xiàng)目；山東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師國(guó)內(nèi)訪問學(xué)者項(xiàng)目；科研基地-生物技術(shù)在制藥和農(nóng)產(chǎn)品加工中的應(yīng)用平臺(tái)建設(shè)（PXM2010_014306_109857）

陳亮（1986—），男（漢），博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物分離。

*通信作者

2011-12-14