6種食用菌菌絲體多糖含量的比較

熊芳，孫淑靜，肖穎，胡開輝

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

6種食用菌菌絲體多糖含量的比較

熊芳，孫淑靜，肖穎，胡開輝*

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

以熱水浸提的方法分別從香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝的菌絲體中提取多糖，并用苯酚-硫酸法對多糖含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明,這6種食用菌菌絲體的多糖含量分別為，4.84%、3.45%、7.72%、3.14%、11.18%和5.22%。同時(shí)通過對羥自由基清除能力的測定對這6種多糖進(jìn)行抗氧化活性研究，結(jié)果表明,雖然茶樹菇多糖含量最高，但其清除羥自由基的能力最弱；鳳尾菇和秀珍菇的多糖含量相對較低，但羥自由基的清除率較高；而金針菇、赤芝和香菇不僅多糖含量較高，而且對羥自由基的清除能力也較好。相比較而言，金針菇多糖具有更廣闊的開發(fā)利用前景。

食用菌；菌絲體；多糖；抗氧化；羥自由基

香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝這6種食用菌作為我國食（藥）用菌的主栽品種，不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富，還含有多種生物活性物質(zhì)，如維生素、多肽、菌多糖等。多糖是一類具有高活性的生命大分子物質(zhì)，它在抗腫瘤、抗凝血、刺激免疫以及降血糖、清除自由基和抗氧化方面具有一定的作用[1]。研究結(jié)果表明，食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，從而起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用[2]。

20世紀(jì)90年代至今，國內(nèi)外對香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝的子實(shí)體多糖的研究較多，但幾乎沒有對于菌絲體多糖的研究報(bào)道。從菌絲體中提取的多糖具有安全、低毒、來源廣泛等特點(diǎn)，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗氧化劑，具有廣闊的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)通過對6種食用菌菌絲體多糖含量的測定及其對羥自由基的清除能力的測定，比較他們多糖含量和羥自由基清除能力的大小，以找出多糖含量較高且對羥自由基清除能力較好的菌種，旨在為相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)選擇多糖原材料及其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝菌株均為福建農(nóng)林大學(xué)微生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、牛血清蛋白、雙氧水、水楊酸、七水合硫酸亞鐵。以上試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

電子天平（BSA124S）：北京賽多利斯；（恒溫）搖床（SKY-200B）：上海蘇坤；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162）：上海精宏；立式高壓滅菌鍋（LX-B75L）：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；VIS-7220可見分光光度計(jì)：北京瑞利；等。

1.3 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 20 g（液體培養(yǎng)基不需），水 1000 mL，pH 自然，121℃，濕熱滅菌30 min備用。

1.4 菌絲體培養(yǎng)方法

1）將菌種接于PDA斜面培養(yǎng)基上，20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d左右，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

2）將配好的培養(yǎng)基以100 mL/瓶分裝于250 mL三角瓶中，121℃濕熱滅菌30 min，用于接種。

3）采用無菌操作，從斜面上取大小相近的約0.5cm2的母種塊，接種于PDA液體培養(yǎng)基（菌塊要薄，盡量使菌塊漂浮在液面上），每瓶接種3塊～5塊。20℃～25℃靜置24 h，然后置于20℃～25℃、130 r/min左右的搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間因菌類不同而異，一般是10 d左右。

1.5 菌絲體多糖的提取方法[3-4]

熱水浸提和乙醇醇析法。

1.6 菌絲體多糖含量的測定[3-8]

1.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1 g，溶解稀釋后定容有于100 mL容量瓶中，配成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，精密吸取貯備液1 mL定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 25 mL 具塞刻度試管中，加蒸餾水至2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.5mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，振搖，放置10min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光值。

1.6.2 樣品溶液的制備

精密稱取菌絲體粗多糖粉末20 mg，加蒸餾水溶解并定容至250 mL，搖勻，即為待測樣液。

1.6.3 精密度試驗(yàn)

取菌絲體多糖樣品液各2.0 mL，加6%苯酚溶液1.5mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，振搖，放置10min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度,平行測定5次。

1.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取菌絲體多糖樣品液各2.0 mL，加6%苯酚溶液1.5mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，振搖，放置10min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，測定其吸光值在時(shí)間 20、30、40、50、60 min 后的變化。

1.6.5 加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法測定回收率。取菌絲體多糖樣品液各1.0 mL，分別加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1 mL，后用蒸餾水補(bǔ)充至2.0 mL，另以1 mL樣品溶液加1 mL蒸餾水為樣品含量測定，然后分別加6%苯酚溶液1.5 mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度,根據(jù)葡萄糖的檢出量，計(jì)算其回收率：

回收率/%=（實(shí)驗(yàn)測值-樣品所含被測成分量）/加入純品量×100

1.6.6 換算因子的確定

精密吸取該樣品液1.0 mL，蒸餾水補(bǔ)充至2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.5 mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出供試液中的葡萄糖含量，按下式計(jì)算換算因子：

換算因子f=m/（C×D×V）

式中：m為稱取的多糖質(zhì)量,mg；C為多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，（mg/mL）；D為多糖的稀釋倍數(shù)；V為體積，mL。

1.6.7 多糖含量的測定

精密稱取適量干燥后香菇、鳳尾菇、秀珍菇、赤芝的菌絲體樣品1 g以及金針菇、茶樹菇樣品0.5 g，分別置于具塞三角瓶中，按一定料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間，在熱水浴中浸提5 h，用布氏漏斗抽濾后加2倍體積無水乙醇溶液，靜置24 h后，離心，沉淀用蒸餾水溶解，定容至250 mL，即為待測樣液。

精密吸取樣品液1.0 mL，于具塞刻度試管中，加蒸餾水至2 mL，各加6%苯酚溶液1.5 mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度，平行測定3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)C，并按下式計(jì)算樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

多糖含量=（C×D×V×f）/W×100%

式中：W為稱取子實(shí)體或菌絲體的樣品質(zhì)量，mg；f為換算因子；C為多糖液中葡萄糖的含量，（mg/mL）；D為多糖的稀釋倍數(shù)；V為體積，mL。

1.7 多糖對羥自由基清除能力的測定[9-12]

1.7.1 樣品溶液的制備

精密稱取一定質(zhì)量的菌絲體粗多糖粉末，加蒸餾水溶解，使其配制成一定濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的待測樣液。

1.7.2 多糖對羥自由基清除能力的測定

精密吸取4.5 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，相應(yīng)濃度的待測溶液1 mL，于試管中，最后加入4.4 mmol/L H2O21 mL以啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)。37℃反應(yīng)0.5 h后，12000 r/min離心6 min，然后以蒸餾水作參比，在510 nm下測定吸光度?？紤]待測溶液本身的吸光值不同，以待測溶液1 mL，4.5 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL和蒸餾水1 mL作為待測溶液的本底吸收值。清除率計(jì)算公式為:

清除率＝[A0－（AX－AX0）]/A0×100%

式中：A0為空白對照液的吸光度；AX為待測溶液后的吸光度；AX0為待測溶液的本底吸收值。每一吸光值平行測3次，取其平均值，結(jié)果用X±SD表示，并采用t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定結(jié)果

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及相應(yīng)吸光值見表1，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及相應(yīng)吸光值Table 1 Consistence and OD of the glucose standard solution

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可看出，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，表明質(zhì)量濃度在0.01 mg/mL～0.07 mg/mL時(shí)，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光值之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，很好地符合了郎伯—比爾定律。

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 菌絲體多糖精密度實(shí)驗(yàn)Table 2 The experiment to calculate the precision of mcelia polysaccharide

由表2可知，香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖樣品溶液5次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 為 0.85%、0.77%、0.92%、0.63%、0.82%和0.74%（n＝5），均小于1%，表明實(shí)驗(yàn)的精密度較好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 菌絲體多糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 3 The experiment to calculate the stability of mcelia polysaccharide

由表3可知，香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖溶液的吸光值在顯色后的20 min～60 min內(nèi)變化不大，說明了在此段時(shí)間范圍內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.1.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 菌絲體多糖溶液回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 The experiment to calculate the recovery of mcelia polysaccharide

由表4可知，5次平行測定RSD均小于1%（n＝5），又根據(jù)1.6.5中公式，求得香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖樣品溶液回收率分別為99.4%、100.9%、101.6%、108.1%、109.6%和102.3%，六者回收率均在99%～110%之間，表明本實(shí)驗(yàn)的測定方法是可靠、可行的。

2.1.5 多糖含量的測定結(jié)果

按照1.6.7所述方法，平行測定3次香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖提取液的吸光值如表5?？芍?，菌絲體多糖的含量茶樹菇＞金針菇＞赤芝＞香菇＞鳳尾菇＞秀珍菇。

2.2 多糖對羥自由基清除能力的測定結(jié)果

多糖對羥自由基清除能力的測定結(jié)果見表6。

表5 菌絲體多糖樣品溶液的吸光值Table 5 The OD of polysaccharides sample solution from the mycelium

由試驗(yàn)結(jié)果可知，6種食用菌菌絲體多糖對羥自由基清除能力都比較好（在多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，最大清除率在64%～84%之間），且在一定濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）范圍內(nèi)六種食用菌菌絲體多糖對羥自由基清除能力隨著多糖濃度的增大而增大。

表6 多糖對羥自由基的清除能力Table 6 The Hydroxyl radical scavenging of polysaccharides in mycelium

3 結(jié)論與討論

自由基在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是指含有未配對電子的基團(tuán)、分子或原子，包括超氧陰離子、羥自由基（·OH）、脂質(zhì)過氧化物（LPO）等。它是人體內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物。在正常情況下,人體內(nèi)的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡中，但是一旦該平衡被打破,就會(huì)對機(jī)體造成損害，從而引發(fā)一系列相關(guān)疾病[13]。研究發(fā)現(xiàn)，許多天然食品（柴胡[14]、馬齒莧[15]、山藥[16]等）中的多糖都具有清除自由基、抗氧化的能力，而食用菌多糖由于其毒副作用小、安全性強(qiáng)，與動(dòng)物和植物多糖相比具有產(chǎn)量和質(zhì)量不受自然條件影響的特點(diǎn)，被越來越多的人所關(guān)注。

本試驗(yàn)通過熱水浸提以及芬頓（Fenton）反應(yīng)法從6種食用菌的菌絲體中提取多糖并測定其抗氧化活性。結(jié)果表明，雖然茶樹菇多糖含量最高（11.18%），但其清除羥自由基的能力最弱（在多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，最大清除率在65%）；鳳尾菇和秀珍菇雖清除率較高（在多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，最大清除率分別為80%和71%），但他們多糖含量較低（分別為3.45%和3.14%）；而金針菇、赤芝和香菇不僅多糖含量較高（依次為7.72%、5.22%和4.84%），而且對羥自由基的清除能力（在多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，最大清除率依次為82%、84%和75%）也較好，其中以金針菇的多糖含量和清除能力的比例最好，這為下一步對金針菇的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

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The Comparison of the Polysaccharides Obtained from Six Different Edible Fungus Mycelia

XIONG Fang,SUN Shu-jing,XIAO Ying,HU Kai-hui*
（College of Life Sciences,Fujian Agricultural and Forest University,Fuzhou 350002,Fujian,China）

The polysaccharides from Lentinus edodes,Plurotus sajorcaju,Flammulina velutiper,Pleurotus geesteranus,Agrocybe chaxingu and Ganoderma lucidum mycelium were extracted by boiling water method,and the content of polysaccharides was measured by Phenol-Sulfuric Acid Method.The results showed that the contents of polysaccharides in the six mushroom mycelium were 4.84%,3.45%,7.72%,3.14%,11.18%and 5.22%.At the same time,the antioxidant activity of the six polysaccharides was determined through the determination of hydroxyl radical scavenging capacity.The results showed that although Agrocybe chaxingu contained the highest of polysaccharide,the weakest of hydroxyl radical scavenging capacity;Flammulina velutiper,Ganoderma lucidum and Lentinus edodes,not only had more polysaccharide,and the ability of clearing hydroxyl radical was better,among them.In comparison,the polysaccharide from Flammulina velutiper has a wider development foreground.

edible fungus;mycelium;polysaccharide;antioxidant;hydroxyl radical

福建省教育廳科技項(xiàng)目（JA09097）

熊芳（1983—），女（漢），助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，食用菌活性物質(zhì)開發(fā)與利用。*

2011-12-07