中性蛋白酶對(duì)臘牛肉加工中蛋白質(zhì)影響的研究

穆建穩(wěn)，董全，李洪軍

（1.貴州省六盤水市鐘山區(qū)科技局，貴州 六盤水 553000；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716）

中性蛋白酶對(duì)臘牛肉加工中蛋白質(zhì)影響的研究

穆建穩(wěn)1，董全2，李洪軍2

（1.貴州省六盤水市鐘山區(qū)科技局，貴州 六盤水 553000；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716）

在臘牛肉腌制中，將中性蛋白酶按原料肉重的0.010%、0.015%、0.020%、0.025%和0.030%的添加量摻入腌制劑中腌制7 d，發(fā)現(xiàn)肉中非蛋白氮含量和氨態(tài)氮含量隨著腌制天數(shù)的增加而大幅度增加，表明在此期間，肌肉蛋白質(zhì)在酶的作用下發(fā)生了強(qiáng)烈降解。降解程度隨著酶添加量增大而提高。

臘牛肉；中性蛋白酶；蛋白質(zhì)

臘牛肉(牛干巴)是我國西南地區(qū)獨(dú)具特色的以牛肉為加工原料的半干肉制品，加工歷史悠久，風(fēng)味獨(dú)特，深受當(dāng)?shù)馗髯迦嗣竦南矏踇1]。國內(nèi)對(duì)臘牛肉的研究以及相關(guān)的研究報(bào)告極少，從現(xiàn)有的報(bào)道來看也多是從加工過程中微生物區(qū)系及其變化對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量特征及風(fēng)味的關(guān)系進(jìn)行研究[2-3]，而通過引入酶制劑縮短腌制時(shí)間，加速其成熟的研究鮮見報(bào)道。研究臘牛肉加工過程蛋白質(zhì)的變化及其特點(diǎn)，酶制劑對(duì)臘牛肉加工過程中蛋白質(zhì)變化及感官評(píng)價(jià)的影響，從而為臘牛肉生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化及工業(yè)化，解決傳統(tǒng)臘牛肉生產(chǎn)加工周期長、生產(chǎn)受季節(jié)限制、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等影響其發(fā)展的問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮牛后腿肉；中性蛋白酶（20萬U/g）：由廣西南寧龐博生物工程有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

微量凱氏定氮裝置、10 mL微量滴定管：重慶北碚特種玻璃儀器廠；PHS-3C型精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；FA2004A電子分析天平：上海精天電子儀器廠；TGL-18C高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BL301A4多功能食品粉碎機(jī)：上海賽康電器有限公司。

1.3 分析測(cè)定方法

1.3.1 揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定（半微量凱氏定氮法[4]）

將除去脂肪、骨、腱后的樣品切碎攪勻，準(zhǔn)確稱取10 g置于錐形瓶中，加100 mL蒸餾水，不時(shí)振搖，浸漬30 min。過濾，取濾液備用。

將盛有10mL硼酸吸收液（20g/L）并加有5滴～6滴混合指示劑（2 g/L甲基紅乙醇溶液和1 g/L次甲基藍(lán)水溶液用前等量混合）的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，吸取5.0 mL上述樣品濾液于蒸餾器的反應(yīng)室內(nèi)，加5 mL MgO懸濁液（10 g/L），迅速蓋塞，并加水以防漏氣。通入蒸汽進(jìn)行蒸餾，由冷凝管出現(xiàn)冷凝水時(shí)開始計(jì)時(shí)，蒸餾5 min。吸收液用0.01 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄消耗量（V1）。同時(shí)做空白試驗(yàn)（V0）。結(jié)果用下式計(jì)算：

式中：TVB-N為試樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量，（mg/100g）；V0為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V1為測(cè)定用樣液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；0.01為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，（mol/L）；14為與1.00 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，mg；m為試樣質(zhì)量，g。

計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定（甲醛滴定法[4]）

準(zhǔn)確稱取10 g樣品絞碎研磨，于100 mL容量瓶加水定容，浸提1 h，過濾吸取20 mL上清液于燒杯，加60 mL蒸餾水，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 8.20，加入10 mL甲醛溶液，混勻。再用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 9.20，記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V1）同時(shí)做空白試驗(yàn)（V0）。結(jié)果用下式計(jì)算：

式中：AN為試樣中氨基酸態(tài)的含量，（g/100 g）；V0為試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V1為測(cè)定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；0.05為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，（mol/L）；0.014為與1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；m為試樣質(zhì)量，g。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

1.3.3 總氮、蛋白氮與非蛋白氮的測(cè)定

1.3.3.1 總氮的測(cè)定

凱氏定氮法，GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.3.3.2 蛋白氮與非蛋白氮的測(cè)定[4]

準(zhǔn)確稱取樣品2 g置于750 mL凱氏燒瓶中，加水50 mL，再加入幾粒玻璃珠和1滴～2滴硅酮消泡劑。將混合物徐徐煮沸，消化0.5 h。趁消化液尚熱時(shí)，加入2 mL硫酸鋁鉀溶液（100 g/L）搖勻后重新加熱至恰好沸騰。加入50 mL醋酸銅溶液（30 g/L），充分混合，冷卻后過濾，用50 mL冷水洗滌燒瓶及沉淀。

（A）測(cè)定蛋白氮時(shí)，將濾紙和沉淀放回原燒瓶中，按1.3.3.1方法測(cè)定氮含量。（B）測(cè)定非蛋白氮時(shí)，將濾液轉(zhuǎn)入另一清潔的凱氏燒瓶中，按1.3.3.1方法測(cè)定氮含量。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

新鮮牛肉→切塊→稱重→腌制→沖洗→晾掛→烘烤干燥→冷卻→真空包裝→成品

1.4.2 酶在腌制過程中對(duì)蛋白質(zhì)變化的影響

將中性蛋白酶按不同添加量摻入根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)最佳配方的腌制劑中，在4℃條件下腌制7 d，每24小時(shí)取樣進(jìn)行非蛋白質(zhì)氮、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定。酶的種類及添加量見表1。

表1 酶制劑種類及添加量表Table 1 Enzymatic preparation species and adding dosage

2 結(jié)果與分析

2.1 酶在腌制中對(duì)非蛋白質(zhì)氮含量變化的影響

目前國內(nèi)在肉類工業(yè)上主要用之進(jìn)行肉的嫩化、蛋白水解提取水解產(chǎn)物等。在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)用蛋白酶進(jìn)行肉的嫩化及水解時(shí)，容易造成肉質(zhì)地軟糊并產(chǎn)生腐臭味和水解物中苦味肽較多[5]，因此應(yīng)控制其用量及水解程度。

非蛋白質(zhì)態(tài)氮是由多肽，小肽，氨基酸等一些小分子的含氮物質(zhì)組成的，是風(fēng)味物質(zhì)的重要前體物質(zhì)，對(duì)肉制品的風(fēng)味有重要影響[6]。中性蛋白酶在腌制過程中對(duì)非蛋白質(zhì)氮含量的影響見圖1。

圖1 中性蛋白酶在腌制中對(duì)非蛋白質(zhì)氮含量的影響Fig.1 The effect of neutral protease to content of NPN during the curing processing

從圖1可以看出，經(jīng)過7 d的腌制，樣品中非蛋白質(zhì)態(tài)氮的含量隨著添加量的增加也迅速提高，0.010%添加量使非蛋白質(zhì)氮含量從腌制時(shí)的1.39%增加到1.82%，與腌制前相比提高了30.94%；0.02%添加量使非蛋白質(zhì)氮含量從1.35%增加到1.97%，與腌制前相比提高了45.93%；0.030%的酶使含量從1.37%增加到2.23%，與腌制前相比提高了62.77%。

2.2 酶在腌制中對(duì)氨態(tài)氮含量變化的影響

氨基酸不僅是肉制品風(fēng)味物質(zhì)的重要前體物質(zhì)，它本身也對(duì)肉制品的滋味有重要影響，不同的氨基酸呈現(xiàn)不同的味道，甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸具有甜味作用；精氨酸、組氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、胱氨酸具有苦味作用；絲氨酸和谷氨酸具有鮮味作用[7]。除了對(duì)滋味的貢獻(xiàn)外，游離氨基酸也是一些揮發(fā)性香味物質(zhì)的前體。如來源于纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸Strecker降解的2-甲基丙醛，2-甲基丁醛，3-甲基丁醛、含硫化合物、吡嗪，以及來源于蛋氨酸、半胱氨酸和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的呋喃類化合物[7]。可見肉制品中氨基酸的種類與含量對(duì)肉品的風(fēng)味至關(guān)重要。

中性蛋白酶在腌制中對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖2。

圖2 中性蛋白酶在腌制中對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 The effect of neutral protease on the content of AN during the curing processing

從圖2看出在7 d的腌制過程中樣品的氨態(tài)氮含量在酶的作用下呈現(xiàn)總體上升趨勢(shì)，趨勢(shì)隨酶量增加而增強(qiáng)，在以原料肉重0.010%的添加量下，氨態(tài)氮的含量從0.0803%增加到0.090%，與腌制前相比提高了12.08%；在0.020%的添加量下氨態(tài)氮含量從0.081%增加到0.103%，與腌制前相比提高了27.65%；在0.030%的添加量下氨態(tài)氮含量從0.0822%增加到0.122%，與腌制前相比提高了48.66%。

2.3 酶在腌制中對(duì)TVBN含量變化的影響

揮發(fā)性鹽基氮是蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下發(fā)生分解產(chǎn)生的氨及胺類物質(zhì)，也是評(píng)價(jià)肉及肉制品鮮度的主要衛(wèi)生指標(biāo)，它的含量在一定程度上標(biāo)志著肉及肉制品的腐敗程度。

圖3 中性蛋白酶在腌制中對(duì)TVBN的影響Fig.3 The effect of neutral protease on the content of TVBN during the curing processing

中性蛋白酶在腌制中對(duì)揮發(fā)性鹽基氮的影響見圖3?？芍?，在腌制7 d后樣品中揮發(fā)性鹽基氮含量都有較大程度的提高，其中添加了0.030%（原料肉重）的揮發(fā)性鹽基氮含量超過了15 mg/100 g，但通過對(duì)氣味及顏色的觀察并沒有明顯的腐敗變質(zhì)特征。而這種現(xiàn)象在我國傳統(tǒng)肉制品如火腿、臘肉中均發(fā)現(xiàn)在腌制階段及后熟、貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮的含量都隨著時(shí)間的延續(xù)而增加[8-9]。由此表明，在臘牛肉（牛干巴）中加入酶制劑使TVBN含量明顯增加，但這種增加在短期的腌制時(shí)間內(nèi)不足以引起肉品的腐敗。而且蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的復(fù)雜產(chǎn)物恰好賦予了臘牛肉（牛干巴）獨(dú)特的風(fēng)味。

3 結(jié)論

在臘牛肉（牛干巴）腌制中，中性蛋白酶以原料肉重的0.010%、0.015%、0.020%、0.025%和0.030%的添加量摻入腌制劑中腌制7 d，發(fā)現(xiàn)肉中非蛋白氮含量和氨態(tài)氮含量隨著腌制天數(shù)的增加而大幅度增加，表明在此期間，肌肉蛋白質(zhì)在酶的作用下發(fā)生了強(qiáng)烈降解。降解程度隨著酶添加量增大而提高。

在腌制中揮發(fā)性鹽基氮含量有較大程度的提高，其中添加了0.030%（原料肉重）中性蛋白酶的揮發(fā)性鹽基氮含量超過了15 mg/100 g，但通過對(duì)氣味及顏色的觀察并沒有明顯的腐敗變質(zhì)特征。表明在臘牛肉加工過程中加入中性蛋白酶致使TVBN含量明顯增加，但這種增加在短期的腌制時(shí)間內(nèi)不足于引起肉品的腐敗。而且蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的復(fù)雜產(chǎn)物恰好賦予了臘牛肉獨(dú)特的風(fēng)味。

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Study on Effect of Neutral Protease to Protein in the Processing of Dry-Cured Beef

MU Jian-wen1,DONG Quan2,LI Hong-jun2

（1.Science and Technology Department of Zhongshan District,Liupanshui 553000,Guizhou,China;2.College of FoodScience,South-west University,Chongqing 400716,China）

In the process of salting Dry-cured Beef,add neutral protease in the proportion of 0.010%,0.015%,0.020%,0.025%and 0.030%of the beef and salt the beef for 7 d.The experiment shows that the contents of NPN and AN be increased greatly with the increase of the salting days.It shows that the Muscle protein degrades because of the chemical reaction with enzyme.The degradation degree rises with the increase of enzyme.

dry-cured beef;protease;protein

穆建穩(wěn)（1969—），男（漢），工程師，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究與應(yīng)用推廣工作。

2011-12-18