腫瘤壞死因子－α對人表皮黑素細(xì)胞增殖及黑素合成的影響研究

林新瑜，王芳，林鴻剛，段西凌

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610072；2.四川大學(xué)國家生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

黃褐斑、白癜風(fēng)等是臨床上常見的色素障礙性疾病，目前其發(fā)病機(jī)理還不十分清楚，治療難度也較大，影響美觀。黑素細(xì)胞合成黑素是在其特征性細(xì)胞器－黑素小體內(nèi)進(jìn)行的，酪氨酸酶是黑素生成的主要限速酶。本研究建立正常人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，采用不同濃度的腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）作用于體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，觀察其對黑素細(xì)胞生物活性的影響，包括黑素細(xì)胞的增殖、黑素合成和黑素細(xì)胞的凋亡率，從而為研究色素障礙性皮膚病的發(fā)病機(jī)制及色素性疾病的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

MCDB－153培養(yǎng)基，牛胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，LDopa，TNF－α，DMSO，MTT 均購自美國 Sigma公司。重組人表皮生長因子（rhEGF）購于美國Peprotech公司，牛垂體提取物（BPE）購于美國Invitrogen公司。10%新生小牛血清購自Hyclone公司。EDTA－Na2購自美國Gibco公司。氫化可的松0.5μg／ml，青霉素100IU／ml，鏈霉素100 IU／ml，胰蛋白酶，苔盼蘭均系國產(chǎn)。培養(yǎng)瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司；酶聯(lián)免疫檢測儀；流式細(xì)胞儀。標(biāo)本經(jīng)患者知情同意后取自18～35歲行包皮環(huán)切術(shù)的正常人包皮。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

參照文獻(xiàn)［1～4］進(jìn)行黑素細(xì)胞體外純培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)多巴染色、Fontana銀染、S－100蛋白免疫組化染色進(jìn)行鑒定［5］，證實(shí)其為黑素細(xì)胞。

1.2.2 黑素細(xì)胞增殖的測定

采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）［6］，按公式計算其凈抑制率。抑制率＝（對照組－實(shí)驗(yàn)組）／對照組×100%，凈抑制率＝各組的抑制率－溶劑對照組（PBS）的抑制率。

1.2.3 黑素合成的測定

采用 NAOH 法［7］。黑素合成抑制率＝［1－（藥物孔吸光度值÷藥物孔細(xì)胞密度）÷（對照孔吸光度值÷對照孔細(xì)胞密度）］×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測

細(xì)胞培養(yǎng)、計數(shù)等如前，按2×105／孔接種到6孔板，濃度100ng／ml的TNF－α處理組和PBS對照組，空白對照組設(shè)置如前，細(xì)胞處理72h后，分別收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)到相應(yīng)的已經(jīng)收集有各自上清的離心管里，1500rpm離心3min，棄去上清，重復(fù)3次PBS清洗過程后，棄去上清，加入PI溶液，室溫避光孵育30min，上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件10.0版進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞為雙極、三極和多極的樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞增殖良好，細(xì)胞樹突之間交織成網(wǎng)（見圖1）。

2.2 黑素細(xì)胞鑒定

2.2.1 L－Dopa 染 色

第3代黑素細(xì)胞經(jīng)0.1%L－Dopa染色后鏡下見黑素細(xì)胞胞質(zhì)及樹突均被染成灰黑色（見圖2）。

2.2.2 Fontana銀染

3代黑素細(xì)胞經(jīng)氨銀液避光浸染30min，細(xì)胞被染成黑色（見圖3）。

2.2.3 S－100蛋白染色

黑素細(xì)胞胞質(zhì)及樹突呈棕黃色陽性著色從而可以鑒定為黑素細(xì)胞（見圖4）。

2.3 不同濃度TNF－α對人正常皮膚黑素細(xì)胞增殖率（%）的影響

黑素細(xì)胞增殖的測定結(jié)果見表1和表2。

表1 不同濃度TNF－α與PBS作用于黑素細(xì)胞后的抑制率的比較

表1可見，不同濃度TNF－α實(shí)驗(yàn)組對黑素細(xì)胞的抑制率較PBS對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05?；騊＜0.01＊）。

表2 不同濃度TNF－α作用于黑素細(xì)胞后的凈抑制率比較

從表2中可以看出隨作用時間增加，黑素細(xì)胞凈抑制率逐漸增加，而且隨TNF－α的濃度增加，黑素細(xì)胞的凈抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出時間和劑量的相關(guān)性。

2.4 黑素合成的測定結(jié)果

表3 TNF－α作用于黑素細(xì)胞后的黑素合成抑制率的比較

從表3可見，405nm處和450nm處測量吸光度值，按公式計算其黑素合成抑制率均可見TNF－α作用后黑素合成抑制率增加，而且TNF－α組與PBS組比較，統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性差異（P＜0.05＃）。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

濃度為100ng／ml的TNF－α作用于黑素細(xì)胞72h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測的結(jié)果：空白對照組黑素細(xì)胞凋亡率為4.0%，溶劑PBS組黑素細(xì)胞凋亡率為6.7%，TNF－α（100ng／ml）組黑素細(xì)胞凋亡率為35.4%。TNF－α（100ng／ml）組黑素細(xì)胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

皮膚黑素化過程包括黑素細(xì)胞增殖、酪氨酸酶合成和活化以及黑素體的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解。酪氨酸酶是皮膚黑素生物合成的主要限速酶。黑素的合成受細(xì)胞因子、金屬離子、激素等多種因素的調(diào)節(jié)。黑素細(xì)胞的培養(yǎng)在皮膚色素性疾病的研究和治療中具有重要意義。TNF是一種主要由單核巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，影響多種組織和細(xì)胞的生長、分化，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的不同水平起著重要的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)細(xì)胞來源和分子結(jié)構(gòu)的不同，TNF可分為TNF－α和TNF－β型。TNF－α即經(jīng)典的 TNF，主要由細(xì)菌脂多糖（LPS）激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。TNF－β即以往的淋巴毒素（lymphotoxin），主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生。TNF－α正常儲存于真皮肥大細(xì)胞之中［8］，但激活的表皮朗格漢斯細(xì)胞［9］，甚至受到刺激的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞也可合成并釋放TNF－α［10］。黑素合成與細(xì)胞因子間的相互作用已引起學(xué)者們的關(guān)注。隋連金等學(xué)者［11］采用ELISA法測定了白癜風(fēng)患者血清TNF－α水平，并與正常對照組相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者血清T NF－α水平增高，提示其可能參與白癜風(fēng)發(fā)病，并與白癜風(fēng)的活動有關(guān)。曾靜等學(xué)者［12］采用SABC免疫組化法對18例進(jìn)展期及20例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者皮損處TNF－α及其受體TNFR1進(jìn)行檢測，并以20例正常人作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尋常型進(jìn)展期白癜風(fēng)皮損中TNF－α的表達(dá)較尋常型穩(wěn)定期組顯著增加，尋常型穩(wěn)定期白癜風(fēng)皮損中TNF－α的表達(dá)較正常對照組顯著增加，患者組與對照組TNFR1無顯著性差異，提示TNF－α可能參與尋常型白癜風(fēng)發(fā)病的某一環(huán)節(jié)。Swope［13］等研究發(fā)現(xiàn)IL－1、IL－6及 TNF－α3種細(xì)胞因子可抑制培養(yǎng)黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性，此外它們還能抑制黑素細(xì)胞的生長但無細(xì)胞毒性作用，故認(rèn)為它們可能是阻礙黑素細(xì)胞黑素生成的重要因素。本研究建立正常人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)體系后，用不同濃度的TNF－α作用于黑素細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)TNF－α對黑素細(xì)胞活力有抑制作用，能使細(xì)胞增殖力降低，兩者存在明顯的濃度和時間效應(yīng)，濃度越高，抑制率越強(qiáng)，時間越長，抑制率越強(qiáng)，與Swope等［13］的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)TNF－α作為旁分泌的細(xì)胞因子，還可導(dǎo)致黑素合成減少，增加黑素細(xì)胞的凋亡率。但是TNF－α是通過什么通路和機(jī)制達(dá)到這些作用還有待進(jìn)一步的深入研究。

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