基于同步輻射的不同時期腫瘤新生血管形態(tài)結構定量的初步分析

【作 者】向秋靜，李晶，劉蘋，孫建奇

1 上海交通大學生命科學技術學院，上海，200240

2 上海交通大學生物醫(yī)學工程學院和MED-X研究院，上海，200030

0 引言

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤。2008年世界衛(wèi)生組織對各種疾病死亡的統(tǒng)計結果顯示，乳腺癌在高收入國家中位于前十位。 早期發(fā)現(xiàn)，改善乳腺癌結果和提高生存率，仍然是乳腺癌控制的基石[1]。

由于實驗觀察到在沒有血管新生條件下腫瘤生長受到限制，F(xiàn)olkman最早提出了血管依賴性理論[2-3]。進一步有實驗證明，腫瘤惡變與血管新生之間有某種聯(lián)系[4]如腫瘤內(nèi)微血管網(wǎng)絡與腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移間的關系[5-8]。越來越多的研究表明，瘤內(nèi)微血管網(wǎng)絡的密度[9]、彎曲度[10-11]、分叉類型[12]和分形維度(Fractal dimesion,FD)[13-14]等指標能夠有助于區(qū)分正常血管和腫瘤血管。隨著成像技術的發(fā)展，同步輻射光源的產(chǎn)生解決了傳統(tǒng)的血管造影術分辨率不高的問題[15-16]，其對離體腫瘤內(nèi)微血管網(wǎng)絡成像分辨率可達幾十mm或更小[17-20，30]，能夠獲取較為完整的腫瘤微血管網(wǎng)絡。這樣為接下來通過數(shù)字圖像處理技術定量分析腫瘤微血管網(wǎng)絡結構提供了可能。本文針對腫瘤微血管的異常形態(tài)和成像所得到的龐大數(shù)據(jù)量，設計了分塊加載的雙閾值分割方法進行定量前的準備。

目前，微血管密度度(Microvessel densitl，MVD)和腫瘤分級是臨床常用的指導腫瘤治療的定量指標。大量研究指出，乳腺腫瘤的MVD越高意味著較高的復發(fā)率和較低的生存率[9，21-23]。另外，通過活體顯微成像手段觀測實體惡性瘤內(nèi)部新生血管，可得出這樣的結論：高度紊亂、纏繞呈囊狀、分布高度不均勻、血管間距變化大、異常彎曲和擴張、旁通、閉環(huán)、過度分叉和混亂分流[24-27]。對于腫瘤血管網(wǎng)絡這種混亂的結構來說，分形的采用恰好彌補了歐式幾何無法描述復雜無規(guī)則物體描述的缺陷。它用單一數(shù)值（分形維度）描述不規(guī)則物體的復雜度，同時也反映出該物體的生長類型[13]。然而目前關于分形的運用大都集中于2D平面上[28-29]。有別于以前大部分針對2D圖像進行的分形分析，Laurent Risser實驗小組進行同步CT成像的腫瘤模型的分形分析，得到小鼠模型的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的FD為1.9到2.2之間，明顯高于對照組的結果[30]。

本文基于同步輻射的CT吸收成像，提取5個不同生長時間點的腫瘤內(nèi)微血管網(wǎng)絡，采用自主設計的分塊加載雙閾值方法進行大數(shù)據(jù)量三維血管的分割，并對隨時間增長腫瘤內(nèi)微血管網(wǎng)絡的變化，結合觀察結果和定量指標（MVD和FD）進行初步分析。

1 材料和方法

1.1 樣品準備

5周齡BALB/c雌性裸鼠(購買于上海西普爾必凱實驗動物公司)，飼養(yǎng)于IVC獨立鼠籠中，整個環(huán)境嚴格消毒并人工控制12小時晝夜變換光照。裸鼠自由攝取鈷60輻射滅菌飼料及高溫滅菌水。用DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)鼠源4T1乳腺癌細胞于37oC、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，細胞貼壁生長，呈相互連接的片狀。細胞達80%-90%密度時，等量培養(yǎng)基終止后離心，去上清，PBS重懸成細胞懸液，細胞計數(shù)為3×106個/ml，冷凍待用。取0.1 ml細胞懸液分別注入小鼠右側股部背側皮下。

接種后待小鼠清醒后放回專用無菌鼠籠中喂養(yǎng)，提供滅菌后的鼠糧和水，并且定期對鼠籠進行殺菌清潔。待腫瘤接種一定時間后，進行血管灌注和離體腫瘤樣本的采集。實驗共分為5個時間點，分別為20 d、25 d、30 d、35 d和40 d，每個時間點為3個樣本。腫瘤血管灌注采用常見的研究微循環(huán)的造影劑microfil（Flow Tech Inc.）。經(jīng)反復實驗論證，較傳統(tǒng)造影劑硫酸鋇能到達更細小的微血管。灌注過程中用到實驗室自主設計的雙點滴灌注系統(tǒng)，使用0.016g/ml的戊巴比妥鈉溶液，按0.5 ml/100g小鼠體重的比例將小鼠麻醉后，仰臥固定，從劍突至恥骨聯(lián)合開口后，仔細打開胸腔。用0.6×0.25 mm靜脈注射針自心尖扎入左心室，先用40U/ml肝素生理鹽水灌注5 min，然后用福爾馬林溶液灌注5 min，之后勻速推入microfil 大約5 ml。4oC冰箱過夜后，取出腫瘤組織用于成像。

1.2 成像

將灌注后的離體腫瘤放于特制的樣品臺上，利用上海光源X 射線成像及生物醫(yī)學應用光束線站（BL13W）的同步輻射系統(tǒng)進行離體腫瘤樣本的CT成像，使用的探測器最小分辨率為9 mm，探測器距光源為25 cm，能量為20 kev。每個樣本共獲1200CT張斷層圖，每張斷層拍攝角度步進速度為（180/1200）度/張，需時約15 min。得到腫瘤組織新生血管的三維斷層圖像后。利用常規(guī)濾波反投影算法對投影數(shù)據(jù)進行重建，最終的斷層圖轉(zhuǎn)換為8位無壓縮tif數(shù)據(jù)格式進行存儲，由于造影劑和腫瘤周圍組織吸收的巨大差異，使得結果具有很好的對比度，能夠較完整的保留微血管結構。對斷層圖進行簡單的光照強度歸一化后，導入三維圖像處理軟件Amira (Mercury Computer Systems,Inc./TGS Group)，觀察腫瘤新生血管的三維圖像。

2 圖像分析

2.1 圖像處理

由于大量的微血管直徑約為20mm左右，采用單一閾值分割勢必會過分割或欠分割，無法較好地提取完整而正確的腫瘤新生血管網(wǎng)絡，因此采用雙閾值完成血管的分割。首先，利用Frangi提出的基于不同尺度空間的血管增強濾波器，進行細小血管的增強[31]。由于該濾波器能夠自主選擇想要增強的管狀物體的尺度，因此僅采用較小尺度（sigma=1,2）增強細小血管，也避免了由于大尺度所造成的血管過度平滑和粘連的現(xiàn)象。另外，該濾波器對于背景噪聲也有較好的抑制作用，有利于接下來利用單一閾值進行細小血管的分割。然后，分別對增強前后的圖像進行閾值分割，得到較大的血管和較小的血管。將兩種圖像進行疊加，運用形態(tài)學閉操作填補疊加后的斷層血管內(nèi)部的空洞，同時運用開操作和重構去掉長度過短（根據(jù)實驗樣本測試得出結構元素取線型，長度取15像素效果最好）的物體后，得到最終的分割結果。

2.2 圖像分區(qū)

如圖1所示，取腫瘤中間三分之一段的三維圖像進行統(tǒng)計分析，并且按照不同的半徑將選區(qū)分為三個互不相交的子分區(qū)，分別稱作外圍區(qū)域（R1）、過度區(qū)域（R2）和中心區(qū)域（R3），其目的在于探討腫瘤生長過程中不同區(qū)域內(nèi)血管生長變化與分布的關系。(a)20 d腫瘤的部分采樣區(qū)域的體繪制；(b)以不同顏色來分別表示不同的分區(qū)，從外到內(nèi)依次為1區(qū)、2區(qū)、3區(qū)。重建后的數(shù)據(jù)，首先經(jīng)過預處理解決斷層之間光照不均的現(xiàn)象，接著利用雙閾值法分割，最后對分割后的血管網(wǎng)絡進行血管密度和分形維度的統(tǒng)計分析。

圖1 腫瘤分區(qū)示意圖。Fig.1 A simple illustration of rezoning from a vertical view

2.3 定量指標

對每一個樣品的不同區(qū)域分別計算MVD和FD。

分形維度描述分形物體對其所在空間填充程度，其計算方法主要有豪斯多夫維數(shù)、計盒維數(shù)和沙盤維數(shù)等，其中最常用是盒維數(shù)。盒維數(shù)的計算是通過用無數(shù)個邊長為r均勻分割的網(wǎng)格來劃分分形物體，然后數(shù)出最少需要多少個網(wǎng)格來覆蓋這個分形，記為N。這樣對網(wǎng)格逐漸精細下去，所需用來覆蓋的網(wǎng)格數(shù)逐漸增加，因此網(wǎng)格大小、覆蓋所需網(wǎng)格數(shù)和分形維度之間的關系如下：

當 r I 0 時，可得到：

本實驗中采用盒維數(shù)來代表腫瘤微血管的分形維度，簡稱FD。

3 結果

3.1 腫瘤體積變化

將4T1乳腺癌細胞接種于小鼠右側股部背側皮下，待該瘤體生長20 d、25 d、30 d、35 d、40 d時，測得腫瘤體積分別為（0.088±0.025）cm3、（0.195±0.058）cm3、（0.512±0.068）cm3、（0.686±0.151）cm3、（0.988±0.276）cm3。腫瘤體積隨時間一直在不斷增大，并且在20 d到25 d變化較為緩慢，而25 d到30 d的增幅最大。

圖2 皮下接種4T1細胞后腫瘤的生長曲線 （n=3）Fig.2 Growth of tumor after injected subcutaneous transplantation of 4T1 cells(n=3)

3.2 瘤內(nèi)微血管形態(tài)變化

從腫瘤的CT圖像重建后的體繪制圖（圖3和圖4）可以看出，腫瘤內(nèi)部新生血管分布不均勻，局部血管呈絮狀，分布密集，雜亂無章，有許多較大的無血管區(qū)域。20 d的腫瘤血管較粗；20 d到25 d腫瘤血管迅速增加，且以細小血管為主，極為密集；到30 d MVD明顯下降，形成大片的無血管區(qū)域；隨后腫瘤MVD遞減，到40 d僅剩在靠近腫瘤邊緣的地方有少量血管。

圖3 隨時間增長瘤內(nèi)微血管的形態(tài)變化Fig.3 Development of tumor microvascular over time

圖4 20 d腫瘤血管的三維重建圖Fig.4 Visualization of reconstructed tumor microvessel structure of Day 20

3.3 分區(qū)定量結果

為了更好的研究腫瘤血管不同區(qū)域的分布情況，將腫瘤中間三分之一段取出，然后按半徑從外到內(nèi)依次劃分為三個區(qū)域(圖1)，分別稱作外圍區(qū)域(1區(qū))、過度區(qū)域(2區(qū))和中心區(qū)域(3區(qū))，對腫瘤進行分區(qū)域的MVD和FD計算，結果圖5所示。每個分區(qū)內(nèi)的血管密度隨時間呈拋物線分布，25 d時MVD最大，40 d時MVD最小。從觀察MVD的空間分布(圖3)來看，20 d到25 d時血管分布較為均勻，25 d以后中心血管密度減少較快。與MVD結果一致的是FD也在25 d達到最大，此后逐漸遞減，到40d時FD最小，且越往中心FD越小。預示著腫瘤血管在量變的同時也有著“質(zhì)”的變化，即結構復雜度的變化。FD的數(shù)值范圍，與以前關于腦腫瘤分形結果相符[30]。

表1 不同生長時間、不同分區(qū)的腫瘤微血管密度的統(tǒng)計結果Tab.1 Quantitative estimates of microvessel density(MVD)of different growth periods and different subregions.

表2 不同生長時間、不同分區(qū)的腫瘤微血管分形維度的統(tǒng)計結果Tab.2 Quantitative estimates of microvessel fractal dimension(FD)of different growth periods and different subregions

圖5 不同時間和不同分區(qū)內(nèi)的MVD和FD分布圖（n=3）Fig.5 Microvessel density and fractal dimension distribution at different time and in different locations(n=3).

5 討論

實驗得出的不同生長時間腫瘤微血管網(wǎng)絡的分形維度的變化趨勢與MVD的變化趨勢基本一致，均為先增大后減小，體現(xiàn)出腫瘤從增長到退化的一個生長周期。這個生長周期也包含著腫瘤內(nèi)部微血管網(wǎng)絡密度和復雜度的共同變化。腫瘤從無到有再到40 d的生長時間過程中，25 d時腫瘤血管分行維度和血管密度同時達到最大，與直觀的觀測結果一致，體現(xiàn)腫瘤目前正處于高度活躍狀態(tài)，形態(tài)結構最為復雜。然而，從分別比較各個時間點的不同區(qū)域血管定量結果來看，中心區(qū)域血管密度始終較邊緣低，且血管體積在25 d到30 d這個過渡期出現(xiàn)了迅速飛躍，血管密度在25 d前后有著驟升和驟降的過程。由此推斷乳腺腫瘤在生長過程的前期(25 d前)和后期(25 d后)與腫瘤血管的生長速度變化有關。在腫瘤生長前期即20 d到25 d這段時間，腫瘤新生血管迅速增長，依次比較三個分區(qū)，第25 d的平均血管密度分別約為第20 d的9倍、7倍、9倍，而腫瘤平均體積由0.088增大到0.195，增大約2.2倍；第25 d到第30 d時，體積由0.195迅速增至0.512，增大約2.6倍。而各個分區(qū)內(nèi)的平均血管密度則分別由0.0637、0.0598、0.0657下降了至0.0130、0.0038、0.0074，下降了至少約5倍以上，體積增長的速度遠遠大于血管新生的速度，使得血管密度在25 d到30 d的時候迅速下降。這可能與4T1細胞株的高度惡性有關，其生長后期腫瘤細胞繁殖過快與血管新生速度不匹配，導致營養(yǎng)供給跟不上，造成腫瘤內(nèi)大量壞死和轉(zhuǎn)移。從實際解剖結果也可以看到，不同時間點腫瘤的肺轉(zhuǎn)移，符合該類惡性腫瘤的基本特征。

盡管FD變化趨勢與MVD一致，但是FD的統(tǒng)計方差卻遠遠小于MVD的。這不僅證明腫瘤血管并非預想中的單純由外向內(nèi)的滲透性生長，或者即使是滲透型生長模式，那在不同區(qū)域其生長的速度也必然受到局部微環(huán)境的影響而會有所不同，個體差異顯著。另外，還證明分形與血管密度間的關系，不僅僅是單純意義上的百分比，更重要分形描述的是不同尺度下密度分布的相似性。這一特性使FD更適用于對于腫瘤血管的大面積篩查，而不必認為應選血管密集區(qū)域（如hot-spot[6]），進行定量，降低了人為因素的干擾，大大提高了定量結果的客觀性。

本研究以同步輻射CT成像為基礎，得到微米級的腫瘤內(nèi)部微血管網(wǎng)絡，采用自主設計的分塊加載雙閾值分割方法進行定量前的準備，通過觀察不同時間的腫瘤體積和不同分區(qū)的血管密度和分形維度的變化趨勢，初步分析腫瘤隨時間變化的生長過程。實驗證明了分形分析對于研究腫瘤血管的潛力，也說明了對于復雜的腫瘤血管定量，不能靠單一指標進行描述，而需要多個指標進行綜合評定。這樣才能更加全面解讀腫瘤新生血管對于腫瘤生長的重要意義。

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