一種適用于PCR檢測(cè)的苧麻陳年原麻DNA提取方法

陳平，譚龍濤，喻春明，王延周，陳繼康，熊和平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長(zhǎng)沙410205)

苧麻(Boehmeria nivea L.Gand)為蕁麻科苧麻屬多年生宿根性草本植物，是我國(guó)特色的韌皮纖維作物。苧麻經(jīng)收獲剝制干燥得到原麻，從原麻及脫膠后精干麻外觀無法區(qū)分不同的品種。要對(duì)苧麻原麻進(jìn)行品種溯源和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，首先要提取原麻的DNA。苧麻DNA的提取，都是以幼嫩葉片或種子為試材［1－3］，目前還未見有關(guān)從苧麻原麻中提取DNA的報(bào)道。由于苧麻含有多糖、多酚及其它次生代謝產(chǎn)物，陳年原麻中DNA隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)而降解嚴(yán)重，用常規(guī)CTAB法很難提取出DNA。本試驗(yàn)參照中藥材DNA提取的方法［4－6］，采取延長(zhǎng)提取時(shí)間、加多種抗氧化劑和除蛋白的方法對(duì)苧麻陳年原麻基因組DNA提取進(jìn)行了研究，并對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行了分光光度、瓊脂糖凝膠電泳及PCR檢測(cè)，為苧麻原麻DNA提取及轉(zhuǎn)基因檢測(cè)尋找了一條有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

植物材料為2005年和2010年采集的苧麻品種“中苧一號(hào)”頭麻的原麻，試驗(yàn)在2011年7月進(jìn)行。

CTAB 提取液:質(zhì)量濃度為 2%CTAB(Cetyltriammonium bromide)，1.4mol/L NaCl，100mmol Tris－HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA，質(zhì)量濃度為3%PVP，3%β － 巰基乙醇。

PCR所用的Taq DNA聚合酶、dNTP等均購于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

具體方法如下:取先用無菌水浸泡過的苧麻原麻0.5g(剪成小塊利于研磨)，迅速放入液氮，迅速研磨成粉末。再加入0.5ml 2%CTAB提取液(預(yù)熱至55℃)，然后55℃水浴1h左右，期間多次振蕩離心管，再放入4℃冰箱中過夜提取。第二天加入0.5ml(24:1)氯仿/異戊醇，4℃12000r/min離心10min，小心吸取上清液并轉(zhuǎn)入另一個(gè)滅菌1.5ml離心管中，加入300ul 10mol/L NH4AC和600ul異丙醇放置在－20℃下沉淀5h，然后4℃下12000r/min離心10min，棄液相，用70%乙醇清洗DNA 1－2次，將DNA沉淀自然風(fēng)干，然后加200ul TE溶解備用。

1.2.1 DNA純度及完整性測(cè)定

以λ/HindⅢ作為分子量參照物，用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。用紫外線分光光度計(jì)測(cè)定所提取DNA溶液的OD260和OD280，測(cè)3次取平均值，算得A260/A280。根據(jù)OD260值按照1個(gè)OD260nm值相當(dāng)于50ng/ul和稀釋倍數(shù)來換算DNA的濃度，并計(jì)算DNA的產(chǎn)量。

1.2.2 DNA的PCR鑒定

PCR擴(kuò)增引物CL是根據(jù)苧麻木質(zhì)素合成相關(guān)基因4CL基因序列設(shè)計(jì)，序列為:前引物5＇－AGGATACAAGAGGAGGGAAGAG －3＇，后引物:5＇－ ATACGGTCAACCACGTAAAGAT －3＇。

PCR 擴(kuò)增采用20ul反應(yīng)體系，體系包括 DNA 模板 2ul、引物 1ul、dNTPs(2.5mM each)2ul、10×Tag buffer(含 Mg+)2ul、Taq －DNA 聚合酶(5U)0.3ul，加 ddH2O 至20ul。

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性3min，94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，34個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72℃延伸5min。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度和產(chǎn)量

從表1可以看出，提取的2010年和2005年苧麻原麻DNA的D260/D280都在1.8－2.0之間。但保存時(shí)間不同的原麻DNA產(chǎn)率有差異，2010年原麻提取的DNA濃度明顯高于2005年原麻，而且2010年原麻的產(chǎn)率高于2005年原麻的產(chǎn)量。原因可能是隨著保存年份的增加，原麻中的DNA逐漸發(fā)生降解，另外樣本液中蛋白質(zhì)、多糖和酚類等雜質(zhì)污染，導(dǎo)致DNA純度和產(chǎn)量發(fā)生變化。

2.2 DNA的電泳檢測(cè)

對(duì)所提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，從圖1中可以看出，四個(gè)樣品提取的DNA都有條帶，但2010年原麻提取DNA的條帶明顯比2005年原麻的清晰。說明苧麻原麻經(jīng)過機(jī)械剝制和長(zhǎng)時(shí)間保存，DNA發(fā)生了部分降解，含量較低。

2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

將提取DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明(圖2)，2010年和2005年原麻提取的DNA均可擴(kuò)增出清晰譜帶。說明雖然從苧麻陳年原麻中提取的DNA的濃度較低，但是能夠滿足PCR分析的要求。

圖2 苧麻原麻提取DNA的PCR鑒定Fig.2 PCR amplification of 4CL gene of ramie

3 討論

苧麻原麻中含有大量的多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，而且越老，這些物質(zhì)含量就越高。尤其是多糖，可與DNA同時(shí)沉淀，使DNA提取物呈膠狀，從而影響對(duì)DNA樣品的濃縮，干擾后續(xù)操作。因此大多數(shù)試驗(yàn)都是以苧麻幼嫩葉片為材料，但幼嫩部位材料的采集會(huì)受到季節(jié)限制。我們嘗試過用常規(guī)CTAB法提取原麻基因組DNA，但結(jié)果不理想。本研究在傳統(tǒng)CTAB提取方法的基礎(chǔ)上，采取延長(zhǎng)提取時(shí)間、加多種抗氧化劑和蛋白分離的方法對(duì)苧麻基因組DNA進(jìn)行提取。分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，2010年原麻提取出的DNA產(chǎn)量和純度、產(chǎn)量均高于2005年原麻，說明苧麻原麻基因組DNA隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)降解，存放時(shí)間越長(zhǎng)，提取難度越大。PCR檢測(cè)表明存放6年的苧麻原麻仍能夠提取出DNA，雖然提取的DNA濃度較低，但PCR條帶較亮，能夠滿足分子檢測(cè)的需要。此提取方法可很好的解決苧麻嫩葉取材的時(shí)間限制，保證試驗(yàn)的順利進(jìn)行，同時(shí)為陳年原麻品種溯源和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)提供了有效的方法。

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