樹莓果實(shí)上產(chǎn)酯酵母菌的篩選和鑒定

馬榮山，穆晶，王艷平

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

樹莓果實(shí)上產(chǎn)酯酵母菌的篩選和鑒定

馬榮山，穆晶*，王艷平

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

從樹莓綠色果實(shí)上分離出一株產(chǎn)酯性能較好的菌株MJ-green-2010，經(jīng)形態(tài)與培養(yǎng)特征，酵母菌假菌絲鑒定，生理生化實(shí)驗(yàn)和分子水平鑒定，確定為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

樹莓果實(shí)；產(chǎn)酯酵母菌；篩選；鑒定

從目前已有的資料看，樹莓其生產(chǎn)工藝都是先將性能優(yōu)良的酵母菌株經(jīng)過(guò)馴化后進(jìn)行樹莓產(chǎn)品的釀制[1]。菌株的優(yōu)良特性在馴化過(guò)程中有可能全部或部分喪失，嚴(yán)重影響發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量。為此，采用直接從樹莓果上分離酵母菌株，并對(duì)其進(jìn)行部分生理生化和分子水平鑒定[2-4]，以期從樹莓果實(shí)上直接得到適應(yīng)于樹莓果汁特殊環(huán)境的優(yōu)良酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌來(lái)源：MJ-green-2010來(lái)自沈陽(yáng)東陵樹莓基地的樹莓果實(shí)。

試劑：蛋白胨、酵母膏、瓊脂等為國(guó)產(chǎn)生化試劑；葡萄糖、EDTA、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、醋酸鉀等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；引?6S rDNA D1/D2區(qū)域NL1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3'）和NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'）由上海生工公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-VJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；TC-412PCR儀：TECHNE制造；DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京市六一儀器廠；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)：Anke制造；移液槍：eppendorf制造；UNIVERSALHOODS.N.76S/03822凝膠成像儀：BIO-RAD制造。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的篩選[5-8]及形態(tài)鑒定

樹莓果實(shí)來(lái)自沈陽(yáng)東陵樹莓基地，將現(xiàn)場(chǎng)無(wú)菌操作采集的樣品MJ-green-2010，浸入滅好菌的YPD液體培養(yǎng)基中，于25℃，48 h～72 h擴(kuò)大培養(yǎng)，然后利用梯度劃線法和稀釋梯度分離法分離純化，用YPD斜面培養(yǎng)基保藏，然后觀察液體培養(yǎng)[9]和固體培養(yǎng)的菌體形態(tài)特征。

1.3.2 酵母菌理化鑒定[10-11]

1.3.2.1 糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

接收端在用戶數(shù)據(jù)階段判斷/F/、/A/字節(jié)出現(xiàn)的位置,根據(jù)其是否出現(xiàn)在相應(yīng)的幀尾/多幀尾,即可監(jiān)測(cè)通道的同步狀態(tài),如果同步則需將/F/、/A/字節(jié)替換回原始用戶數(shù)據(jù);不同步則統(tǒng)計(jì)錯(cuò)誤個(gè)數(shù),超過(guò)錯(cuò)誤閾值則表明鏈路失去幀/多幀同步,需進(jìn)行重同步過(guò)程。

常規(guī)鑒定需要測(cè)試6種糖（葡萄糖、D－半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和D－果糖）的發(fā)酵結(jié)果。將這6種糖用蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的母液，過(guò)濾，滅菌。用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的酵母浸出溶液，每次取出3.6 mL分裝于口徑12 mm的試管中，放入倒置的杜氏發(fā)酵管，棉塞封口，滅菌，然后每管內(nèi)加入0.4 mL糖母液，備用。將活化好的菌種制成細(xì)胞懸液，以每管0.5 mL的量接種于發(fā)酵試管內(nèi)，搖勻，25℃下培養(yǎng)2周，其間觀察杜氏管內(nèi)是否有氣體產(chǎn)生。杜氏管內(nèi)有氣泡計(jì)為陽(yáng)性，無(wú)氣泡計(jì)為陰性。

1.3.2.2 碳源同化實(shí)驗(yàn)

液體試管法：每管加無(wú)碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基5 mL，加被測(cè)試的某種碳源（葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、乳糖、乙醇、可溶性淀粉、D-木糖、半乳糖、D-甘露醇、檸檬酸、肌醇），并以葡萄糖作對(duì)照。接入新鮮菌液1 mL，1周～2周后，觀察。液體試管法培養(yǎng)同化結(jié)果的觀察與記錄方法：取一白色卡片，其上用墨汁或黑色墨水劃上約3/4 mm寬的直線，透過(guò)培養(yǎng)液觀察卡片上的黑線。透過(guò)試管看不見黑線記為+，為陽(yáng)性；黑線清晰可見記為-，為陰性。

1.3.2.3 氮源同化實(shí)驗(yàn)

將測(cè)試酵母菌進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，以消耗細(xì)胞內(nèi)多余的氮源，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。將活化好的菌株接種在無(wú)菌碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，加入被測(cè)氮源（硫酸銨、亞硝酸鈉、硝酸鉀），25℃培養(yǎng)3 d～5 d。操作方法同上。

1.3.2.4 其它生理生化實(shí)驗(yàn)

37℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、耐高滲D-葡萄糖生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)）及生成類淀粉化合物實(shí)驗(yàn)37℃下生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、耐高滲D-葡萄糖生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、生成類淀粉化合物實(shí)驗(yàn)等參照《酵母菌鑒定手冊(cè)》。

1.3.3 酵母菌分子水平鑒定[12-13]

提取菌株MJ-green-2010的基因組DNA，然后用合成引物NL1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3'）和 NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'）[14-16]PCR擴(kuò)增其26S rDNA近5'端的D1/D2區(qū)域，PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，54℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min。36個(gè)循環(huán)[17-19]，72℃延伸10 min，然后冷卻至4℃。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（總體積50 μL）：Primer 1（10 pmol/μL）2.5 μL；Primer2（10 pmol/μL）2.5 μL；dNTP（200μmol/L）1.0 μL；10×Buffer 5.0 μL；TaqDNA聚合酶 （0.83×10-7kat/μL）1.25 μL；模板DNA 2.5 μL；ddH2O 35.25 μL。對(duì)所提取的DNA進(jìn)行凝膠電泳觀察，觀察后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由某生物工程公司進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用GenBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，再用DNASTAR中的MegAlign進(jìn)行相似性分析，經(jīng)MegAlign法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的篩選和形態(tài)鑒定

經(jīng)過(guò)分離純化得到單一菌落從形態(tài)上確定為酵母菌。將菌株MJ-green-2010液體培養(yǎng)特征為液體變渾濁，無(wú)膜醭，有白色膜狀沉淀，有白色絮狀沉淀，液體顏色變淺。固體培養(yǎng)特征為菌落呈乳白奶酪狀，表面反光，邊緣平滑。菌體細(xì)胞呈兩端出芽，形狀為橢圓形、圓形、檸檬形。有子囊孢子形成，每個(gè)子囊含1個(gè)～4個(gè)子囊孢子，孢子呈卵圓形，無(wú)假菌絲產(chǎn)生。

2.2 酵母菌理化鑒定

菌株MJ-green-2010的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)見表1，碳同化實(shí)驗(yàn)見表2，氮同化實(shí)驗(yàn)見表3，其他生理生化實(shí)驗(yàn)見表4。

表 1 MJ-green-2010菌株糖類發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of sugar fermentation test by MJ-green-2010 strain

表 2 MJ-green-2010菌株碳源同化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of carbon assimilation by MJ-green-2010 strain

表 3 MJ-green-2010菌株氮源同化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of nitrogen assimilation by MJ-green-2010 strain

表 4 MJ-green-2010菌株其它生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of other physiological and biochemical test by MJ-green-2010 strain

2.3 酵母菌分子水平鑒定

酵母菌MJ-green-201026S rDNA近5'端的D1/D2區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為561bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖如圖1。

將測(cè)序結(jié)果在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行BLAST分析，然后用DNASTAR軟件中的MegAlign進(jìn)行相似性分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所建發(fā)育樹見圖2。

基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列和MegAlign分析繪制的系統(tǒng)樹。由序列比對(duì)結(jié)果以及相似性分析，可以得出所測(cè)菌株MJ-green-2010與有孢漢遜酵母（Hanseniaspora）屬的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）的26S rDNA的保守序列的相似性達(dá)99%。

3 結(jié)論與討論

在形態(tài)方面，首先觀察待測(cè)菌株的形態(tài)是否為酵母菌形態(tài)。要進(jìn)一步區(qū)分種，主要依據(jù)生理、生化特征及其分子水平的鑒定確定分類地位。注意出芽的各種方式，若產(chǎn)生子囊孢子，則應(yīng)注意子囊孢子的形狀、大小、數(shù)目。此外，還應(yīng)注意是否形成真菌絲和假菌絲。

本實(shí)驗(yàn)分離到的MJ-green-2010菌株，經(jīng)形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)國(guó)際權(quán)威的酵母菌鑒定系統(tǒng)[20]鑒定為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA序列同BLAST比對(duì)，菌株MJ-green-2010與有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）26S rDNA的保守序列的相似性達(dá)99%，確定其為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

在綠色樹莓果實(shí)上存在葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）這種酵母菌，它是一種產(chǎn)酯性能良好的酵母菌，同時(shí)也是發(fā)酵啟動(dòng)菌，在發(fā)酵初期環(huán)境比較適合這種酵母菌生長(zhǎng)繁殖，將它使用在樹莓果酒或者果醋等生產(chǎn)工藝中，可以產(chǎn)生更好的風(fēng)味，也可以使發(fā)酵進(jìn)行更順利。

[1]吳大偉，張建華，張成林，等.沙棘果汁飲料的研制[J].食品工業(yè)，2006，26(2)：18-19

[2]白逢彥，賈建華，梁慧燕.假絲酵母屬疑難菌珠大亞基rDNAD1/D2區(qū)域序列分析及其分類學(xué)意義[J].菌物系統(tǒng)，2002，21(1)：27-32

[3]Cletus P Kurtzman，Christie J Robnett.Identification andphylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S)ribosomalDNApartialsequences[J].Antonievanleeuwenhoek，1998，73(3)：331-371

[4]Jack W Fell，Teun Boekhout，Alvaro Fonseca，et al.Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by largesubunitrDNAD1/D2domainsequenceanalysis[J].Internationaljournal ofsystematicandevolutionarymicrobiology，2000，50(3)：1351-1371

[5]陳蘭蘭，童軍茂，賈明之，等.優(yōu)良增香葡萄酒酵母菌的篩選[J].中外葡萄與葡萄酒，2008，43(6)：28-31

[6]李梓，王軍.山葡萄酵母菌株的分離及初步鑒定[J].食品科技，2008，29(9)：1-4

[7]董亮，趙長(zhǎng)新，竇少華，等.高發(fā)酵度酵母的篩選及鑒定[J].工業(yè)微生物，2007，37(1)：53-56

[8]喬代蓉.產(chǎn)甘油酵母菌株的分離與鑒定明[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，5(2)：986-989

[9]萬(wàn)永青，田瑞華，段開紅，等.沙棘果上天然酵母菌的發(fā)酵特性研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，9(4)：96-98

[10]周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè) [M].北京：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：12

[11]巴尼特JA，佩恩Rw，亞羅D.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)[M].山東：青島海洋出版社：199

[12]許超德，李紹蘭.核酸分子系統(tǒng)學(xué)方法在酵母菌分類中的應(yīng)用進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2004，31(3)：126-139

[13]焦紅茹，劉樹文，祖顯生，等.赤霞珠相關(guān)酵母菌的分離及其分子生物學(xué)鑒定[J].釀酒科技，2007，53(12)：17-20

[14]劉愛(ài)國(guó)，劉延琳，王澤舉，等.寧夏葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的分子生物學(xué)鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36(11)：203-207

[15]Kurtzman C P，Robnett C J.Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in 5'end of the large-subunit(26S)ribosomal DNA gene[J].Microbiol，2005，35(7)：1216-1223

[16]Takashi Sugita，Akemi Nishikawa.Fungal identification method based on DNA sequence analysis：reassessment of the methods of the pharmaceutical society of japanese pharmacopoeia[J].Journal of health science，2003，49(6)：531-533

[17]白逢彥，賈建華，梁慧燕.假絲酵母屬疑難菌珠大亞基rDNA D1/D2區(qū)域序列分析及其分類學(xué)意義[J].菌物系統(tǒng)，2002，21(1)：27-32

[18]徐艷文.甘肅地區(qū)葡萄酒相關(guān)酵母菌的分離及其分類鑒定[D].陜西西安，西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，2007，57(5)：27-33

[19]Kreger-van Rij Groningen N Y W.The yeasts：a taxonomic study[M].In：Fourthd revised and enlarged edition.The Netherlands：Elsevier Science Publishers B V，1984，29(4)：53-59

[20]Jack W Fell，Teun Boekhout，Alvaro Fonseca，et al.Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by largesubunitr DNAD1/D2domain sequence analysis[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2001，50(9)：135-137

The Production Ester Yeasts'Screening and Identification of Raspberry Fruit

MA Rong－shan，MU Jing*，WANG Yan－ping
（College of Food，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，Liaoning，China）

The MJ－green－2010 which is the good performance of producting ester was isolated from the green raspberry，after morphological and cultural characteristics，identification of yeast pseudohyphal，physiological and biochemical tests and identification of the molecular level，it was identified as Hanseniaspora uvarum of Hanseniaspora.

Raspberry fruit；product ester yeast；screening；identification

沈陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目（F10-118-3-00）

馬榮山（1960—），男（漢），副教授，本科，研究方向：食品科學(xué)、食品生物技術(shù)。

*通信作者：穆晶（1986—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

2011-06-29