精子質(zhì)量綜合評估指標的建立*

趙洪鑫 王 會 武俊青 袁 瑤 吳曉蕓 施惠娟△

常規(guī)精液檢查是評估男性生育力的重要手段，主要包括精液量、pH值、精子密度、動力學(xué)參數(shù)、形態(tài)學(xué)參數(shù)等指標〔1〕。每個獨立的精液檢測指標都不能全面地評價男性的生育力狀況，臨床上往往綜合參考多個指標。但指標太多對臨床醫(yī)生的診斷增加了困難。為簡化臨床診斷，武俊青等〔2〕曾對精液檢查的結(jié)果進行主成分分析來綜合評價精液質(zhì)量。但僅依靠常規(guī)精液檢查仍難以有效指導(dǎo)男性不育的診斷，更不足以在輔助生殖技術(shù)中準確評估精子功能，因此需要更多更好的精子功能檢測來系統(tǒng)評估男性生育力〔3〕。研究表明，用熒光復(fù)合染色法檢測存活精子率(live/dead sperm viability)能夠評估精子質(zhì)膜完整性〔4〕。與伊紅染色，精子低滲腫脹實驗(hypo-osmotic swelling test，HOST)相比，熒光復(fù)合染色法能更有效地反映精液中死活精子的比例，在輔助生殖技術(shù)的實驗室診斷中更有應(yīng)用價值。精液中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)主要由精液中的白細胞和畸形精子產(chǎn)生，與精子DNA損傷密切相關(guān)，是一個能夠反映精子受精能力的獨立指標〔5〕。本實驗室用熒光染色法對臨床精液標本進行了精子質(zhì)膜完整性的檢測〔6〕，并首次報告了用化學(xué)發(fā)光法檢測的中國男性不育人群精液ROS水平〔7〕。在前期大樣本研究的基礎(chǔ)上，本文擬對精液樣本的檢測結(jié)果進行主成分分析和多變量線性組合，探討建立精子質(zhì)量綜合評價指標的可行性。

資料與方法

1.研究對象

273名2007年因不育癥在上海計生所醫(yī)院進行精液檢查的男性，納入標準:同居兩年以上未避孕，性生活正常而未育。排除標準:臨床診斷為女性因素導(dǎo)致的不育;無精子癥;精液不液化。同期納入35名已婚育的志愿者。納入標準:已育男性。排除標準:最近一次生育時間超過5年。作為建立綜合指標的數(shù)據(jù)來源。

另選取100名2009年因不育癥在上海計生所醫(yī)院進行精液檢查的男性。同期納入30名已育志愿者。納入標準同上。用以對建立的綜合指標進行預(yù)測評估分析。

2.常規(guī)精液檢查

根據(jù)WHO標準〔8〕收集精液。待精液完全液化后使用CASA系統(tǒng)(Cyto-S;Alpha Innotech Corp)檢測以下指標:

(1)精子密度(×106/mL)

(2)活動率(活動精子百分比)

(3)曲線速率(curvilinear velocity，VCL;μm/s)

(4)直線速率(straight-line velocity，VSL;μm/s)

(5)平均路徑速率(average path velocity，VAP;μm/s)

(6)直線性(linearity，LIN;%)

(7)頭部搖擺頻率(amplitude of lateral head displacement，ALH;μm)

3.精子形態(tài)學(xué)檢查

根據(jù)WHO標準〔8〕，采用Diff-Quik染色法評價精子形態(tài)學(xué)指標。計算正常形態(tài)精子率(sperm morphology)。

4.用熒光復(fù)染法檢測精子質(zhì)膜完整性

用Live/Dead Sperm Viability Kit(L-7011;Invitrogen)檢測精子質(zhì)膜完整性，計算存活精子率(viability):

5.用化學(xué)發(fā)光法檢測精液ROS水平

將400 μL完全液化后的精液加入一次性照度計容器內(nèi)。取4 μL魯米諾儲存液(25 μM于二甲亞砜)，同時加入8 μL辣根過氧化物酶(12.4 U的Ⅵ型辣根過氧化物酶，310 U/mg)。使用Berthold照度計檢測化學(xué)發(fā)光信號約5 min，直至其達到穩(wěn)定。發(fā)光信號測量單位為相對化學(xué)發(fā)光強度(RLU/s)。

6.統(tǒng)計分析方法

精液各指標檢測結(jié)果采用描述性統(tǒng)計分析，兩組間的比較用Wilcoxon秩和檢驗;指標之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析;對精液主要指標進行主成分分析;在各精液指標和ROS水平值中設(shè)定不同的分界點以預(yù)測男性不育，繪制受試者工作特征曲線(receive operating characteristic curve，ROC)，計算曲線下面積并進行分析。統(tǒng)計分析采用SAS 9.2軟件包;ROC曲線的繪制和分析采用Medcalc 9.6軟件。

結(jié) 果

1.一般情況和精液檢查結(jié)果

2007年的不育患者年齡為(30.97±5.13)歲，不育年限為(4.31±2.77)年。已育志愿者，年齡為(33.15±4.46)歲。精液檢測結(jié)果見表1，由于各指標均不呈正態(tài)分布，因此用中位數(shù)、25和75百分位數(shù)描述。

表1 已育志愿者和不育患者精液主要指標檢測結(jié)果(Median(P25，P75))

2.精液參數(shù)之間的相互關(guān)系

對273例不育男性的精液參數(shù)進行Spearman等級相關(guān)分析，除ROS外的其他精液參數(shù)之間均呈正相關(guān)，精子動力學(xué)參數(shù)之間(活動精子率、VCL、VSL、VAP、LIN、ALH)有較強的正相關(guān)。精子密度和精子動力學(xué)參數(shù)、形態(tài)學(xué)參數(shù)呈中等程度的正相關(guān)。而存活精子率與活動精子率僅有中等程度的正相關(guān)。ROS除與精子形態(tài)有較弱的負相關(guān)外，與其他精液參數(shù)均無顯著相關(guān)性，結(jié)果見表2。

表2 重要精液指標spearman相關(guān)系數(shù)矩陣

3.主成分分析結(jié)果

由于ROS與其余的精液參數(shù)無顯著相關(guān)，是一個相對獨立的指標，因此對其余9個指標進行主成分分析。

進行主成分分析之前需將原始變量進行標準化變換。本研究中有4個指標是百分率，因此采用對數(shù)轉(zhuǎn)換的方法進行標化:將9個指標——精子密度、活動精子率、VCL、VSL、VAP、LIN、ALH、正常形態(tài)精子率、存活精子率加1后取以10為底的對數(shù)。標化的目的在于:減少過偏數(shù)值的影響;消除不同指標由于各自量綱不同帶來的影響;減小由數(shù)量級差異帶來的影響，如×106和 ×104。

各主成分的特征根、貢獻率和累計貢獻率見表3。

表3 主成分分析的結(jié)果

第一個主成分解釋了總變異的71.46%，第二個主成分解釋了總變異的9.49%。前2個主成分解釋了超過80%的總變異，因此取前兩個主成分就基本上反映了原資料的信息。

第一、第二主成分按照下式計算:

Prin1=0.259155×lg(精子密度+1)+0.369788×lg(活動精子率 +1)+0.387720×lg(VCL+1)+0.384482×lg(VSL+1)+0.391107×lg(VAP+1)+0.360037×lg(LIN+1)+0.373514×lg(ALH+1)+0.195413×lg(存活精子率+1)+0.194042×lg(正常形態(tài)精子率+1)

Prin2=－0.425385×lg(精子密度+1)－0.174125×lg(活動精子率 +1)－0.112581×lg(VCL+1)+0.029970×lg(VSL+1)－0.014354×lg(VAP+1)+0.162610×lg(LIN+1)－0.153000×lg(ALH+1)+0.805555×lg(存活詳精率+1)+0.276007×lg(正常形態(tài)精子率+1)

由上式可知，第一主成分各分量的大小大致相當，說明第一主成分是一個綜合指標，全部系數(shù)為正，因此第一主成分代表了精液的綜合質(zhì)量;第二主成分在活精子率上有較大的系數(shù)，在精子密度上系數(shù)也較大且為負，說明第二主成分高的精液其精子質(zhì)膜完整性較高但密度較低，因此第二主成分代表了精子在體外存活的狀態(tài)。因此，在臨床預(yù)測自然受孕時第一主成分更有意義，而第二主成分可能在輔助生殖技術(shù)中有潛在應(yīng)用價值。

為方便臨床診斷，取第一主成分來評價精液綜合質(zhì)量，在已育志愿者中，Prin1的均值為4.6253513，標準差為0.2470433。對Prin1進行標準化處理并命名為精液質(zhì)量得分(semen quality score，SQ)，使已育志愿者組SQ的均值為100，標準差為10，即SQ＞110為高質(zhì)量精液，SQ＜90為低質(zhì)量精液，計算原理和方法與智商(IQ)類似:

4.多變量線性組合建立綜合診斷指標

對于擁有CASA系統(tǒng)并能檢測存活精子率的男科學(xué)實驗室，可以采用SQ來評估男性生育能力，而有條件檢測精液ROS水平的實驗室，可以進一步用SQ和ROS兩個指標聯(lián)合預(yù)測男性不育。

下面以logistic回歸為基礎(chǔ)，采用多變量線性組合的方法〔9，10〕將SQ得分和ROS水平同時應(yīng)用，建立聯(lián)合預(yù)測因子。

以是否不育為應(yīng)變量，SQ和lg(ROS+1)為自變量，擬合logistic回歸模型，由于ROC資料中疾病狀態(tài)為二項分布，logit連接函數(shù)參數(shù)是OR(odds ratio)的對數(shù)，較容易解釋模型中參數(shù)變化的含義，故選用logit連接函數(shù)。

模型中各參數(shù)如表4所示。擬合結(jié)果用下式表示:

表4 logistic回歸模型擬合結(jié)果(n=308)

對logistic回歸方程進行變換得到預(yù)測因子Lβ(Y):

得到聯(lián)合預(yù)測因子的表達式:

5.ROC曲線分析結(jié)果

在273例不育男性和35例已育志愿者中，根據(jù)上面得到的公式計算每份精液的SQ值和SQ+ROS聯(lián)合診斷指標值，并比較傳統(tǒng)的精液指標(精子密度、活動精子率、正常形態(tài)精子率)和SQ得分診斷男性不育的ROC曲線，如圖1。而以SQ、ROS及SQ+ROS聯(lián)合指標診斷不育的ROC曲線見圖2。

圖1 不同精液參數(shù)診斷男性不育的ROC曲線

圖2 SQ和精液ROS水平診斷男性不育的ROC曲線

用各精液參數(shù)診斷男性不育的ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)見表5。SQ的ROC曲線下面積大于其余所有單個指標。而SQ-ROS聯(lián)合預(yù)測因子的ROC曲線下面積在所有指標中最大。

表5 不同精液參數(shù)診斷男性不育的ROC曲線下面積

6.最佳參考值的確定

在進行ROC曲線分析的過程中，計算各個指標取不同的臨界點時診斷的靈敏度和特異度，計算約登指數(shù)(Youden index)最大時的臨界點作為最佳參考值。各指標取最佳參考值時的靈敏度和特異度見表6。

表6 各中精液指標的最佳參考值

7.用綜合指標預(yù)測男性不育

利用新建立的精液綜合指標對2009年收集的100例男性不育和30例已育志愿者進行模擬診斷，根據(jù)前面得到的最佳參考值及世界衛(wèi)生組織推薦的參考值預(yù)測不育，并與實際結(jié)果相比較，計算其靈敏度和特異度。在使用世界衛(wèi)生組織推薦的單個指標參考值時，特異度較高但靈敏度普遍偏低。而采用SQ+ROS綜合指標時，靈敏度和特異度均較高，見表7。

表7 精液各指標預(yù)測男性不育的靈敏度和特異度

討 論

光鏡下的人工精液檢查曾經(jīng)是大部分實驗室的常用的診斷方法。隨著技術(shù)的進步，計算機輔助精子質(zhì)量分析(computer-aided sperm analysis，CASA)系統(tǒng)逐漸在男科實驗室普及，CASA使得檢測結(jié)果更加靈敏、迅速、客觀、準確〔11〕。而CASA的結(jié)果報告中有多個指標，包括精子數(shù)量和動力學(xué)參數(shù)等。然而，僅僅使用這些常規(guī)指標尚不能很好地診斷男性不育。近年來，采用熒光染色法檢查精子質(zhì)膜完整性可以更精確地評估精子的存活狀態(tài)。評價精子質(zhì)量的指標很多，單獨應(yīng)用不夠全面，指標多又增加了臨床醫(yī)生對病情判斷的難度。為了減少指標的數(shù)量，提高診斷效率，本研究將高度相關(guān)的指標如精子密度、活動精子率、精子動力學(xué)參數(shù)、形態(tài)學(xué)指標、膜完整性進行主成分分析，計算出精液質(zhì)量得分SQ，用SQ來綜合評價精液質(zhì)量。

對ROC曲線進行分析后發(fā)現(xiàn)，SQ的曲線下面積高于單獨應(yīng)用任何一種常規(guī)精液質(zhì)量指標，說明SQ能夠較好地診斷男性不育。因此，在能夠進行常規(guī)精液分析和檢測存活精子率的實驗室可以參考SQ來評估精液綜合質(zhì)量。

精液ROS的水平反映了氧化應(yīng)激狀態(tài)，而且ROS水平與精子DNA完整性相關(guān)，是一個評價精子功能的重要指標〔12〕。另外，ROS水平除了診斷男性不育外，在預(yù)測出生缺陷、預(yù)測輔助生殖技術(shù)成功率方面也有應(yīng)用價值〔13，14〕。本研究采用基于logistic回歸的多變量線性組合構(gòu)建SQ-ROS聯(lián)合預(yù)測因子來診斷男性不育，其ROC曲線下面積大于單獨應(yīng)用SQ或ROS，具有較高的靈敏度和特異度。盡管上述指標ROC曲線下面積都不及半透明帶結(jié)合試驗((hemizona assay，HZA)〔15〕，但該試驗操作復(fù)雜，實驗材料來源有限，在臨床上不可能批量檢測。而SQ和ROS都是目前在國內(nèi)適宜推廣的檢測指標。

本研究通過主成分分析，建立了精液綜合質(zhì)量得分SQ，作為一般男科實驗室診斷男性不育的參考;通過多變量線性組合，構(gòu)建SQ-ROS聯(lián)合預(yù)測因子，適合在有條件檢測精液ROS水平的男科實驗室應(yīng)用，并可用于輔助生殖技術(shù)中對精液質(zhì)量的評估。綜合指標和最佳參考值建立后，對現(xiàn)有的臨床資料進行了模擬預(yù)測診斷，其靈敏度和特異度都較高，可進一步推廣。

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