諾麗發(fā)酵果汁抗氧化實(shí)驗(yàn)研究

李煦照，于純淼，陳佳，劉樹民，*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

諾麗（Morinda citrigolia L.，Noni），也稱海巴戟，屬茜草科植物，是一種發(fā)源于南太平洋島嶼的熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分。在太平洋群島，波利尼西亞人和庫(kù)克人認(rèn)為他們的祖先應(yīng)用海巴戟治療疾病有2000多年的歷史，主要用于抗感染和治療慢性疾病，是波利尼西亞人和庫(kù)克人最主要的藥用植物之一，在民間廣為應(yīng)用[1]，傳統(tǒng)用于抗衰老、糖尿病、口臭、口腔潰瘍、痔瘡、腫瘤、結(jié)核病、魚肉中毒和高血壓等。本試驗(yàn)研究發(fā)酵諾麗果汁對(duì)溴代苯所致小鼠急性肝損傷的抗氧化功能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

諾麗果汁：購(gòu)于?？?，自然發(fā)酵3個(gè)月，用蒸餾水配成所需濃度；溴代苯：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純（臨用前用食用油配成適宜濃度的供試液）；MDA、SOD、GSH-Px測(cè)定試劑盒及考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，雄性，體重18 g～22 g，清潔級(jí)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)：SCXK黑2008004。

1.1.3 主要儀器

KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；756紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；XHF-1內(nèi)切式組織勻漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 前期給藥

選18 g～22 g健康成年昆明小鼠，雄性，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和受試樣品高、中、低劑量組，每組l0只。按成人體重60 kg計(jì)，受試樣品每次用量為50 mL，1 d 2次，相當(dāng)于1.66 mL/（d·kg）。試驗(yàn)中按成人推薦用量的5、10、20倍，設(shè)高、中、低劑量組。濃度分別為0.21、0.42、0.84 mL/mL，以蒸餾水配制。經(jīng)口給藥，灌胃量為0.2 mL/10 g。30 d后取血測(cè)抗氧化酶活力（GSH－Px、SOD）?？瞻讓?duì)照組經(jīng)口給予同體積溶劑。

1.2.2 造模方法

按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[2]，給藥30 d后，取血測(cè)抗氧化酶活力，此后動(dòng)物饑餓過(guò)夜，第2天給予受試樣品或溶劑1 h后，除空白對(duì)照組外，各組小鼠經(jīng)口給護(hù)溴代苯油（3 mmol/L），灌胃量0.1 mL/10 g。20 h后處死動(dòng)物，取肝組織測(cè)過(guò)氧化脂質(zhì)含量（MDA）和抗氧化酶活力（GSH-Px、SOD）。

1.2.3 樣品制備

1.2.3.1 血清樣品

取血0.5 mL，4000 r/min離心10 min，取血清備用。

1.2.3.2 全血樣品

取血20 μL加入到2.48 mL蒸餾水中，充分振搖，使之全部溶血，4 h內(nèi)測(cè)定酶活力。

1.2.3.3 肝組織上清液

動(dòng)物處死后，立即取出所需肝臟，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎片，稱取適量組織，制成10%組織勻漿，操作在冰浴中進(jìn)行。勻漿以4000r/min，4℃離心10min，取上清液備用。

1.2.4 各指標(biāo)測(cè)定

本試驗(yàn)測(cè)定全血GSH-Px酶活力，血清總SOD活力，肝組織MDA含量，肝組織GSH-Px酶和總SOD活力。

1.2.4.1 GSH-Px活力測(cè)定

采用二硫代二硝基苯甲酸法(DTNB法)。

1）取1∶124全血0.2 mL測(cè)全血GSH-Px酶活力

全血GSH-Px酶活力=（非酶管OD值－酶管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20μmol/L）×5×（1+124）/（1+49）

2）取0.25%組織勻漿0.2 mL測(cè)組織中GSH-Px酶活力

組織中GSH-Px酶活力=（非酶管OD值－酶管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20μmol/L）×5/反應(yīng)時(shí)間/（取樣量×蛋白含量）

1.2.4.2 SOD活力測(cè)定

采用黃漂吟氧化酶法。

1）取血清20 μL測(cè)定總SOD活力

總SOD活力/（U/mL）=（對(duì)照管吸光度－測(cè)定管吸光度）/對(duì)照管吸光度/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)

2）取1%肝組織勻漿25 μL測(cè)定總SOD活力

組織勻漿中SOD活力/（U/mgprot）=（對(duì)照管吸光度－測(cè)定管吸光度）/對(duì)照管吸光度/50%×反應(yīng)液總體積/取樣量（mL）/組織中蛋白含量（mgprot/mL）

1.2.4.3 MDA含量測(cè)定

采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。

取10%肝勻漿0.1 mL測(cè)定MDA含量。

組織中MDA含量/（nmol/mgprot）=（測(cè)定管吸光度－測(cè)定空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）/組織中蛋白含量（mgprot/mL）

1.2.4.4 蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮蘭法

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵諾麗果汁對(duì)小鼠谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力的影響

發(fā)酵諾麗果汁高、中、低三劑量組中全血谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力均高于空白對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異，結(jié)果見表1。

肝損傷實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵諾麗果汁高、中、低三劑量組及空白對(duì)照組中肝組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力均低于模型對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異。高、中、低三組中，隨著劑量的增加，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力反而下降，結(jié)果見表2。

2.2 發(fā)酵諾麗果汁對(duì)小鼠超氧化物歧化酶活力的影響

發(fā)酵諾麗果汁中、低三劑量組血清超氧化物歧化酶活力均高于空白對(duì)照組，中劑量組顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），高劑量組低于空白對(duì)照組，結(jié)果見表1。

表1 發(fā)酵諾麗果汁對(duì)小鼠抗氧化酶活力的影響(血液)（，n=10）Table 1 Fermented Noni Juice on the activity of antioxidant enzymes in mice（blood）

表1 發(fā)酵諾麗果汁對(duì)小鼠抗氧化酶活力的影響(血液)（，n=10）Table 1 Fermented Noni Juice on the activity of antioxidant enzymes in mice（blood）

注：*與空白組對(duì)比P<0.05。

組別GSH-Px/（μmol/L）SOD/（U/mL）空白對(duì)照組 221.76±72.60 138.10±12.08低劑量組 245.72±80.74 138.94±22.24中劑量組 268.32±68.36 170.28±10.49*高劑量組 244.83±83.25 135.41±12.46

表2 發(fā)酵諾麗果汁對(duì)肝損傷小鼠過(guò)氧化脂質(zhì)含量和抗氧化酶活力的影響(肝組織)Table 2 Fermented Noni Juice on lipid peroxide content and the activity of antioxidant enzymes in liver injury mice（liver tissue）

肝損傷實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵諾麗果汁低劑量組中肝組織超氧化物歧化酶活力高于模型對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異，高、中及空白對(duì)照組均低于模型對(duì)照組，結(jié)果見表2。

2.3 發(fā)酵諾麗果汁對(duì)肝損傷小鼠過(guò)氧化脂質(zhì)（MDA）含量的影響

模型對(duì)照組肝組織中過(guò)氧化脂質(zhì)（MDA）含量顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），中劑量組肝組織中過(guò)氧化脂質(zhì)（MDA）含量顯著低于模型對(duì)照組（P<0.05），高、低劑量組組織中過(guò)氧化脂質(zhì)（MDA）含量則高于模型對(duì)照組，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)有一定數(shù)量的自由基，機(jī)體內(nèi)的SOD、GSH-Px等酶可以有效的清除多余的自由基，使體內(nèi)的氧化與還原反應(yīng)保持著平衡狀態(tài)。一旦體內(nèi)的氧自由基大量產(chǎn)生或抗氧化系統(tǒng)功能減弱，都會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)肝組織中空白對(duì)照組與模型組MDA含量有顯著性差異，造成了過(guò)氧化損傷模型。

肝組織中，GSH-Px活力隨著發(fā)酵諾麗果汁劑量的增加而降低，總體呈逐漸下降趨勢(shì)，提示發(fā)酵諾麗果汁具有非常強(qiáng)的抗自由基作用，基本能消除自由基對(duì)肝組織的傷害，對(duì)肝組織具有一定保護(hù)作用[3]。而各劑量組肝組織中的SOD活性無(wú)明顯變化，推測(cè)可能與其在試驗(yàn)中活性代償性反應(yīng)有關(guān)[4]。

各劑量組血中GSH-Px與SOD活力均高于空白對(duì)照組，提示發(fā)酵諾麗果汁對(duì)于未造成過(guò)氧化的動(dòng)物具有增高抗氧化酶活力作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵諾麗果汁可以通過(guò)減少膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，提高機(jī)體清除氧自由基能力，強(qiáng)化抗氧化解毒系統(tǒng)，對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷起到一定保護(hù)作用。

[1]彭勇,肖偉,劉勇,等.世界藥用植物新寵——海巴戟果[J].國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè),2007,22(3):93-96

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].2003:43

[3]馬文濤,楊來(lái)啟,楊喜民,等.維生素C對(duì)應(yīng)激大鼠腦內(nèi)超氧化物歧化酶含量的影響[J].中國(guó)心理衛(wèi)生雜志,2002,16(12):809-810

[4]Gaohua,Zhou yawei.Anti-lipid peroxidation and protection of liver mitochondri against injuries by picrosideⅡ[J].World J Gastroenterol,2005,11(24):3671