玉米超氧化物歧化酶的提取與純化工藝

劉杰鳳，張峰培，杜麗明

（廣東石油化工學(xué)院生物工程系，廣東 茂名 525000）

超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD;EC1.15.1.1)廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，可催化細(xì)胞內(nèi)超氧負(fù)離子（O2－·）的歧化反應(yīng)，使O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，是一種能清除體內(nèi)超氧自由基的金屬酶[1]。對SOD的生理功能研究表明，SOD具有抗脂質(zhì)氧化、抗衰老、抗輻射和消炎的作用，是一種新型的藥用酶及功能性酶，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[2-4]。目前，SOD制品主要從動物血液或肝臟中獲得，但是其應(yīng)用存在安全性問題，而且雜蛋白含量高，人們正逐漸轉(zhuǎn)向通過微生物發(fā)酵和從植物細(xì)胞中提取。已有的研究表明，有些植物的細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)及葉綠體中富含SOD，如蘆薈、大蒜、玉米等[5-7]。尤其是玉米胚和胚乳中富含SOD，是一種具營養(yǎng)和保健作用的主要糧食作物，而且在我國廣泛種植，產(chǎn)量高。在玉米的深加工前，如飼料復(fù)配、淀粉制備、乙醇發(fā)酵等，進(jìn)行玉米SOD的提取，是提高玉米利用率，增加玉米深加工產(chǎn)品種類，深化玉米資源綜合利用的有效途徑。因此，工業(yè)化規(guī)模開發(fā)植物源SOD，玉米是最有潛力的資源之一。本文對玉米SOD提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，目的是找尋安全性能高、提取工藝簡單、提取效率高、成本低的SOD生產(chǎn)工藝。

1 儀器、材料與方法

1.1 主要材料與試劑

糯玉米：茂名官渡市場購買；鄰苯三酚(分析純)、硫酸銨：天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G-250、DEAE-纖維素、N-N’-亞甲基雙丙烯酰胺：北京鼎國生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、丙烯酰胺（分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

TU1810紫外-可見分光光度計(jì)：北京普通分析儀器廠；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)：湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海精密儀器有限公司；DYY-11型電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 玉米SOD的提取及純化

1.3.1 SOD粗酶液的提取工藝

按一定料液比在100 g玉米中加入0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH7.8），28℃浸泡若干小時，淋干。勻漿機(jī)粉碎后，再以磷酸緩沖液30℃浸提1 h，4℃，5000 r/min離心15 min，得玉米SOD粗酶提取液，并對粗酶液進(jìn)行分析。

1.3.2 沉淀分離

1.3.2.1 熱變性

粗酶液于50℃～60℃水浴10 min～15 min，冷卻，5000 r/min離心15 min，棄沉淀。

1.3.2.2 氯仿-乙醇混合液沉淀

取一定體積的粗酶液，加入0.25倍體積的冷氯仿-乙醇混合液（體積比為3∶5），冰水浴中攪拌15 min后，4℃，5000 r/min離心15 min，去除雜蛋白沉淀，上清液靜置分層，棄下層液體，得上層酶液。

1.3.2.3 丙酮沉淀SOD

粗酶液置于冰浴中，緩慢加入4℃預(yù)冷的丙酮，攪拌10 min。5000 r/min、4℃冷凍離心15 min，棄上清，沉淀以50 mmol/L，pH7.8的磷酸緩沖液溶解。

1.3.3 DEAE-纖維素柱層析

粗產(chǎn)品用少量的磷酸緩沖液溶解后，通過預(yù)先經(jīng)過pH7.8的2.5 mmol/L磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱（2.0 cm×30 cm），選用 2.5 mmol/L，pH7.8的起始緩沖液進(jìn)行雜蛋白的洗脫，流速控制在1.2mL/min，直至沒有雜蛋白為止（OD280nm吸光值低于0.1）（約1 h）。然后用2.5 mmol/L～50 mmol/L的pH7.8磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，每管收集9 mL，收集40管，測定各管蛋白含量及酶活，合并活力峰。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳

柱層析純化的酶液經(jīng)冷丙酮沉淀，冷凍離心后，用磷酸緩沖液溶解，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，加樣量20 μL，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.4 測定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)含量及紫外吸收光譜的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定SOD蛋白濃度，以標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以A599為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)作圖，得回歸方程為：y=0.0075x+0.0146，R2＝0.994。

采用TU1810紫外分光光度計(jì)對SOD進(jìn)行光譜掃描（范圍：200 nm～360 nm）。

1.4.2 酶活性的測定及酶活定義

改良的鄰苯三酚自氧化法測定酶活[8]。酶活性單位采用1 mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速度達(dá)50%時的酶量定義為一個活力單位（U），以U/mL表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米SOD粗酶液最佳提取條件的確定

2.1.1 SOD浸泡誘導(dǎo)和浸提過程磷酸緩沖液用量的選擇

SOD在萌發(fā)的植物種子中含量最高，所以對種子進(jìn)行浸泡誘導(dǎo)是獲得SOD高收率的關(guān)鍵[8]。植物SOD多數(shù)為酸性酶，因而浸提常在中性或弱堿性體系中進(jìn)行，常用的緩沖液有磷酸鹽或Tris-HCl緩沖體系，本實(shí)驗(yàn)選用pH7.8、0.05 mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（以下同）。固定玉米用量，分別改變浸泡和浸提的磷酸緩沖液用量，采用鄰苯三酚法測定提取液中酶活力，考察了原料與磷酸鹽緩沖液不同配比對SOD誘導(dǎo)及浸提效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 磷酸緩沖液用量對SOD的誘導(dǎo)及浸提的影響Fig.1 Effect of phosphoric acid buffer solution dosage on induction and digestion of SOD

由圖1可見，對SOD的浸泡誘導(dǎo)來說，緩沖液過少，浸泡不充分，浸泡液量過多，可能是由于氧的不足影響玉米呼吸從而使SOD活性降低，當(dāng)玉米與磷酸緩沖液的配比為1∶1.5～1∶3時，均能得到較好的浸泡效果。而對于浸提來說，玉米與磷酸緩沖液的最佳配比為 1∶2（g/mL）。

2.1.2 誘導(dǎo)與浸提時間的確定

考察了不同浸泡誘導(dǎo)和浸提時間對SOD酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 浸提時間對SOD酶活性的影響Fig.2 Effect of digestion time on SOD activity

由圖2可見，最佳浸泡時間為25 h～30 h，這段時間為玉米種子開始萌發(fā)階段，大量的SOD已合成，而最佳浸提取時間為1.5 h時，此時得到的SOD酶活力最高。

2.2 SOD沉淀分離工藝研究

SOD酶是金屬酶，對熱穩(wěn)定性較高。在SOD的初步分離純化中，常用熱變性、氯仿-乙醇混合物或飽和度為50%以下的硫酸銨鹽析等方法去除雜蛋白，而采用丙酮、聚乙二醇或飽和度為70%～90%的硫酸銨鹽析法沉淀SOD。使用鹽析法的最大優(yōu)點(diǎn)是安全無毒，缺點(diǎn)是后續(xù)需增加透析除鹽工藝，而且玉米中蛋白含量低，而SOD在水中的溶解度大，所用硫酸銨的量較大，而且沉淀分辯率較低。本實(shí)驗(yàn)采用丙酮沉淀SOD，比較了熱變性與氯仿-乙醇混合物除雜蛋白對沉淀分離SOD效果的影響，不同的純化方法及分離結(jié)果見表1。

表1 沉淀分離工藝對SOD純化效果的影響Table 1 Effect of precipitation technology on purification of SOD

由表1可見，方法一除去了88%的雜蛋白，方法二除去了90%的雜蛋白，當(dāng)變性溫度升至60℃時，熱變性除雜蛋白的效果將優(yōu)于有機(jī)溶劑氯仿-乙醇沉淀法。當(dāng)變性溫度升至60℃時，熱變性除雜蛋白的效果與有機(jī)溶劑氯仿-乙醇沉淀法相當(dāng)。采用兩次熱變性沉淀雜蛋白，SOD的酶活力只損失6%，而總蛋白下降了17%，比酶活力提高了14%。可見，方法四是一種較好的純化方法。

2.3 DEAE-纖維素離子交換柱層析

由純化方法四所得沉淀用少量緩沖液溶解后，進(jìn)行DEAE-纖維素柱層析，并測定層析收集到的40管酶液的蛋白質(zhì)含量及酶活力，以試管編號為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，見圖3。

圖3 DEAE-纖維素純化玉米SOD蛋白質(zhì)及酶活力曲線Fig.3 The protein and activity curves of corn SOD by DEAE-cellulase column

由圖3可見，在蛋白質(zhì)分開的3峰中，第1個峰與SOD的活力峰基本重疊，即為玉米SOD的蛋白峰。磷酸緩沖液的濃度約為收集SOD活性峰出現(xiàn)的第11管至20管洗脫液，約為30mmol/L～40mmol/L。經(jīng)DEAE-纖維素層析純化后的酶活見表1。

2.4 玉米SOD的紫外吸收光譜

將經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱分離純化后的SOD磷酸緩沖液在紫外區(qū)（200 nm～340 nm）范圍內(nèi)進(jìn)行吸收光譜掃描，結(jié)果見圖4。

圖4 玉米SOD的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of corn SOD

由于Cu·Zn-SOD含色氨酸或酪氨酸較少，而酪氨酸和色氨酸的最大吸收波長分別為275 nm和280 nm，所以SOD的紫外吸收特征有別于一般蛋白質(zhì)。圖4表明，玉米SOD在紫外區(qū)的最大吸收峰在260 nm處，這與文獻(xiàn)報(bào)道的不同來源的Cu·Zn-SOD紫外吸收（255nm～270 nm）相一致[9]。

2.5 玉米SOD純度的鑒定

采用SDS-PAGE電泳鑒定玉米SOD的純度，將經(jīng)上述各步分離所得蛋白質(zhì)樣品在同一凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖5。

圖5 玉米SOD SDS-PAGE電泳譜圖Fig.5 Picture of SDS-PAGE electrophoresis of corn SOD

由圖5可見，隨著分離的進(jìn)行，蛋白條帶越來越少，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析后，提取酶液只剩一條電泳帶，Cu·Zn-SOD由兩個分子量接近的亞基組成，說明純化的玉米SOD己達(dá)到電泳純。

3 結(jié)論

探討了玉米超氧化物岐化酶（SOD）提取與純化工藝條件，結(jié)果表明：一定量pH7.8、0.05 mol/L的磷酸緩沖液浸泡對玉米SOD的生成有一定的誘導(dǎo)作用，最佳誘導(dǎo)和浸提的原料與緩沖液配比分別為1∶1.5～1∶3、1∶2，最佳誘導(dǎo)和浸提時間分別為25 h～30 h和1.5 h。采用50、60℃兩次熱變性除雜蛋白，丙酮沉淀SOD得到的酶液純度最好，比活力高，而且安全無毒。

沉淀分離的SOD酶經(jīng)DEAE-纖維素柱層析純化后，比酶活達(dá)到1699.7 U/mg，純化倍數(shù)為30.7，酶的回收率為31%。SDS-PAGE電泳表明，純化的玉米SOD己達(dá)電泳純。

紫外光譜掃描結(jié)果表明，玉米SOD紫外區(qū)的吸收峰在260 nm處，而不在280 nm，表明其是含酪氨酸和色氨酸較少的Cu·Zn-SOD。

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