混合物料發(fā)酵產(chǎn)物小分子肽的測(cè)定

朱長波 王勁松 陳清蟬

(1.武漢爍森生物科技有限公司，湖北荊門 448121；2.荊楚理工學(xué)院，湖北荊門 448000)

我國每年產(chǎn)生數(shù)億噸的各類糟粕，一方面沒能很好的利用造成巨大浪費(fèi)，另一方面又從國外進(jìn)口大量大豆。我們將啤酒糟、白酒糟、味精糟、糖糟等農(nóng)副產(chǎn)品及工業(yè)廢料作為主要原料，以其他農(nóng)副產(chǎn)品為輔助原料，加上我們的核心菌種，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)和酶工程技術(shù)，結(jié)合微生態(tài)理論，通過多菌種混合固體發(fā)酵和添加外源復(fù)合酶相結(jié)合的先進(jìn)工藝，生產(chǎn)植物源性酶菌功能營養(yǎng)小肽——肽素35。

過去我們只能用單一的凝膠電泳的檢測(cè)方法,只能單一的判斷小分子肽分子量的范圍,不能準(zhǔn)確的判斷各個(gè)分子量段的含量,從而不能準(zhǔn)確的判斷我們的發(fā)酵產(chǎn)品和別人的產(chǎn)品的差異。為了建立一種科學(xué)、可靠和穩(wěn)定的檢測(cè)方法,我們花了10年時(shí)間，通過大量的方法實(shí)驗(yàn)證明,Shodex尺寸排阻色譜法是一套比較科學(xué)的檢測(cè)方法,該方法對(duì)確定小分子肽含量的測(cè)定準(zhǔn)確、可靠。

1 待檢測(cè)原料肽素35的原料組成及比例（見表1）

表1 肽素35的組成(%)

2 小分子肽的分離提取

2.1 蛋白質(zhì)提取

肽素35樣品粉碎，過0．25 mm的篩網(wǎng)，取100 g溶解在水中，定容到1 000 ml，在50℃的振蕩水浴鍋中振蕩提取15 h，得固液混合物。

2.2 蛋白質(zhì)溶液除雜

提取結(jié)束的固液混合物先用紗布粗過濾一次，然后用濾紙細(xì)過濾一次，離心（轉(zhuǎn)速4 000 r/min，20 min）再次除去部分固型雜質(zhì)。取出上清液體放入冰箱待鹽析。

2.3 鹽析

取800 ml樣品蛋白質(zhì)溶液，稱取440 g硫酸銨，逐漸加入到蛋白質(zhì)溶液中，邊加邊攪拌。待硫酸銨完全溶解后，放入冰箱中，放置時(shí)間15 h。

2.4 離心分離蛋白質(zhì)

將鹽析完成后的蛋白質(zhì)溶液加入到離心管，將離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)到6 000 r/min，離心時(shí)間20 min。將分離出來的蛋白質(zhì)用10 ml的水完全溶解，到入10 ml的試劑管中貯存。

2.5 透析

將分離出來的10 ml蛋白質(zhì)溶液加入到透析袋中（膜孔徑2 nm，截留小分子肽），透析時(shí)間1 h，充分將蛋白質(zhì)中的硫酸銨分離出來，避免該試劑帶來的試劑誤差，透析后得小分肽——肽素35水提物。

3 小分子肽的測(cè)定

3.1 檢測(cè)設(shè)備

LC98II-RI凝膠色譜儀、日本Shodex RI-201H示差折光檢測(cè)器。

3.2 儀器參數(shù)

色譜柱：shodes凝膠柱(Column number E008027)；流動(dòng)相：H2O；流速：1.0 ml/min；標(biāo)準(zhǔn)品：普魯蘭 P-82（內(nèi)裝6瓶不同分子量標(biāo)準(zhǔn)品）；樣品：肽素水提物；進(jìn)樣量：10 μl；實(shí)測(cè)壓力：2.4 MPa；檢測(cè)器：Shodex RI-201h。

3.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取各種我們已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品，分別配成0.5%濃度的溶液，用0.45 μm針式濾器過濾。具體標(biāo)準(zhǔn)品濃度見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品分子量

取以上標(biāo)準(zhǔn)品，按順序?qū)⒁陨蠘?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣10 μl，得到以下標(biāo)準(zhǔn)曲線。縱坐標(biāo)是電壓值，橫坐標(biāo)是各種樣品的響應(yīng)時(shí)間，各點(diǎn)代表相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品峰的響應(yīng)時(shí)間。具體見圖1。

3.3.2 肽素35水提物圖譜

取肽素35水提物,用同樣的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣10 μl,得到測(cè)試譜圖（見圖2）。

圖2 肽素35水提物凝膠色譜儀圖譜

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品和肽素35水提物的圖譜對(duì)比

通過電腦系統(tǒng)將標(biāo)準(zhǔn)曲線圖跟肽素35水提物進(jìn)樣曲線合在一起得到合并圖形（見圖3）。

從圖3我們可以找到標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)的點(diǎn)，從而找到肽素35水提物的分子量，以及對(duì)應(yīng)的蜂面積所代表含量，故通過面歸一法得到肽素35水提物的分子量分布及含量（見表3）。

由表3我們可以看出10 kD以下分量小分子肽所占比例為70.46%。

4 結(jié)論

經(jīng)過我們分離的菌種發(fā)酵后的肽素35，經(jīng)過水提取，鹽析分離，透析除鹽后，過硅膠層析分離柱后得出一系列峰，通過面積歸一法計(jì)算出肽素35分子量范圍在5～100 kD之間，分子量10 kD以下的占水溶性小分子肽含量的70%以上。該檢測(cè)方法是可靠的也是可行的。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和肽素35合并圖

表3 肽素35水提物的分子量分布