幾種脫毒劑對(duì)黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮體外吸附脫毒效果的比較研究

葉盛群 諶 剛

(浙江三鼎科技有限公司，浙江紹興 312000)

霉菌毒素（Mycotoxins）普遍存在于飼料及其原料中，會(huì)對(duì)飼料業(yè)、畜牧業(yè)和人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害[1]。據(jù)報(bào)道，全世界約有25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素的污染。霉菌毒素既可在谷物田間生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生（如鐮刀菌毒素），也可在儲(chǔ)存期間產(chǎn)生（如黃曲霉毒素）。飼料中常見(jiàn)并對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重危害的霉菌毒素主要有：黃曲霉毒素 (Aflatoxin,AF)、玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）、嘔吐毒素(Deoxynivalenol,DON)、煙曲霉毒素（Fumonisins，F(xiàn)UM）等[2-3]。目前處理霉變飼料最成熟有效的方式是吸附法，即通過(guò)在飼料中添加非營(yíng)養(yǎng)性吸附劑，吸附飼料中的霉菌毒素，并與之緊密結(jié)合，使霉菌毒素在通過(guò)動(dòng)物消化道時(shí)不被動(dòng)物所吸收，而直接排出體外，從而避免了霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的危害。常見(jiàn)的霉菌毒素吸附劑主要有：無(wú)機(jī)吸附劑（如天然硅鋁酸鹽類(lèi)礦物材料）和有機(jī)吸附劑（如葡甘露聚糖類(lèi)），但這些吸附劑均存在一定的不足。

為了比較不同脫毒劑間的具體脫毒效果，為更好地解決飼料中霉菌毒素的污染提供理論依據(jù)。本文選取市場(chǎng)上常見(jiàn)9種脫毒劑以及浙江三鼎科技有限公司自行研發(fā)的一種脫毒劑，采用ELISA法，分別檢測(cè)其對(duì)AFB1和ZEN的體外脫毒能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

FA1004分析天平；SK-1快速混勻器；LXJ-IIB型高速離心機(jī)；SHZ-82型恒溫水浴振蕩器；RT-6000酶標(biāo)儀。

1.1.2 試劑

AFB1、ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó) R-Biopharm 公司)；AFB1、ZEN酶聯(lián)免疫定量測(cè)試盒(德國(guó)R-Biopharm公司)；甲醇（色譜級(jí)）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀（均為分析純）。

1.1.3 脫毒劑

市場(chǎng)上常見(jiàn)的9種脫毒劑，其編號(hào)分別為1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#；

浙江三鼎科技有限公司生產(chǎn)的改性蒙脫石，其編號(hào)為10#。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 吸附試驗(yàn)

參照Phillips[4]的方法，在濃度為75 μg/kg的AFB1（1～2 mg/kg ZEN）的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入一定量的上述吸附劑，使各種吸附劑的濃度為2.5 mg/ml，pH值7.0的條件下，37℃、120 r/min的恒溫振蕩水浴鍋上振蕩處理60 min。反應(yīng)結(jié)束后于5 000 r/min下離心10 min，并收集上清液，ELISA法測(cè)定上清液中剩余AFB1和ZEN的含量。按下列公式計(jì)算吸附量Q(μg/g)和吸附率Y(%)：

式中：V為溶液的體積 (ml)；m為吸附劑的用量(mg)；C0、C分別為反應(yīng)前后霉菌毒素的濃度(ng/ml)。

1.2.2 解吸附試驗(yàn)

上述試驗(yàn)結(jié)束后，傾去離心管中上清液，在剩余物中加入10 ml甲醇提取液，在37℃、120 r/min的恒溫振蕩水浴鍋上振蕩處理10 min，反應(yīng)結(jié)束后于5 000 r/min下離心10 min，并收集上清液，ELISA法測(cè)定上清液中AFB1和ZEN的含量,經(jīng)殘液校正后，計(jì)算解吸率。解吸過(guò)程重復(fù)3次,求累積解吸率R(%)。

其中：m為3次解吸上清液中毒素的含量（ng）；m0為解吸附前復(fù)合物中毒素的含量（ng）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)各樣品OD值,用EXCEL 2003計(jì)算各樣品中AFB1和ZEN的含量；所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫毒劑對(duì)AFB1吸附率和解吸附率的影響（見(jiàn)表1）

表1 不同脫毒劑對(duì)AFB1的影響

從表1吸附率看，上述10種脫毒劑對(duì)AFB1均有一定程度的吸附作用，吸附AFB1能力的大小順序?yàn)椋?#＞10#＞1#＞9#＞5#＞2#＞8#＞4#＞7#＞6#，且除 4#、6#、7#三種脫毒劑外，其余七種脫毒劑對(duì)AFB1的吸附脫毒率均在90%以上；從解吸率看，3#和8#雖然對(duì)AFB1具有較高的吸附脫毒率，但同時(shí)解吸率也高，說(shuō)明其吸附AFB1后所形成的復(fù)合物穩(wěn)定性較差。

2.2 不同脫毒劑對(duì)ZEN吸附率和解吸附率的影響（見(jiàn)表2）

表2 不同脫毒劑對(duì)ZEN的影響

由表2可知，上述10種脫毒劑對(duì)ZEN均有不同程度的吸附脫毒作用，并且脫毒劑間吸附脫毒率差異顯著，吸附脫毒率在16%～92%變化。綜合吸附率與解吸率的結(jié)果，10種脫毒劑中對(duì)ZEN吸附脫毒率效果較好的是：10#＞6#＞2#＞1#。

3 討論

影響霉菌毒素脫毒劑脫毒效果的因素很多，如脫毒劑的組成成分，霉菌毒素的分子結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)[5]、飼料原料的霉變程度、脫毒劑的添加量、試驗(yàn)方法以及霉菌毒素的檢測(cè)方法等。

3.1 霉菌毒素理化性質(zhì)的影響

霉菌毒素是一大類(lèi)物質(zhì)，不同種類(lèi)的霉菌毒素由于其分子大小、分子結(jié)構(gòu)、電荷分布以及分子極性等理化性質(zhì)均不同，從而導(dǎo)致同一種脫毒劑對(duì)不同的霉菌毒素吸附脫毒率不同。AFB1分子式C17H12O6，分子量312，其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)⑶褹FB1是一種強(qiáng)極性分子，因此一類(lèi)具有較大比表面積，表面帶有大量親水性無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的物質(zhì)，對(duì)AFB1有一定的吸附脫毒作用，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。ZEN分子式C18H22O50，分子量318，其結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)酚羥基的內(nèi)酯，由于其結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)酯，故易在堿性溶液中將酯鍵打開(kāi)，從而溶于水；當(dāng)堿的濃度降低時(shí)又可將鍵恢復(fù),并且ZEN是一種具有雙極性或弱極性的分子[6]，導(dǎo)致同一種吸附劑對(duì)AFB1和ZEN的吸附脫毒率不同。

3.2 脫毒劑組成成分的影響

脫毒劑的晶體結(jié)構(gòu)和物理特性（包括它的總電荷量、電荷的分布、空隙的大小以及比表面積），是影響霉菌毒素吸附脫毒效果的又一主要因素之一。目前市場(chǎng)上的脫毒劑主要以霉菌毒素吸附劑為主，不同廠家生產(chǎn)的脫毒劑其組成成分不同，如美國(guó)奧特奇公司生產(chǎn)的“霉可吸”主要由釀酒酵母細(xì)胞壁內(nèi)部的提取成分組成，試驗(yàn)研究結(jié)果表明，其對(duì)ZEN具有較好的吸附脫毒率，也對(duì)AFB1具有一定的吸附脫毒能力；這是由于酵母細(xì)胞壁上含有大量的多糖、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，這些物質(zhì)可以通過(guò)氫鍵、離子鍵和疏水作用實(shí)現(xiàn)對(duì)ZEN的吸附脫毒；同時(shí)由于酵母細(xì)胞壁上的寡糖具有較大的比表面積，表面富含不同孔徑的多孔結(jié)構(gòu)，因此對(duì)AFB1也有一定的吸附脫毒作用。浙江三鼎科技有限公司生產(chǎn)的脫毒劑主要由鈣基蒙脫石所組成。天然鈣基蒙脫石屬于2.1型層狀硅酸鹽礦物，由兩層硅氧四面體夾一層鋁氧八面體組成，具有大量的天然納米微孔，結(jié)構(gòu)中存在同質(zhì)取代現(xiàn)象，層間帶有大量可交換陽(yáng)離子[7]，對(duì)AFB1具有較強(qiáng)的吸附脫毒效果，吸附脫毒率達(dá)95%以上，但對(duì)極性弱或非極性物質(zhì)如ZEN和DON，則基本不吸附；本公司對(duì)其經(jīng)過(guò)一定方式的處理后，大大增加了蒙脫石層間的比表面積，增加了蒙脫石的孔徑和孔體積，降低了蒙脫石的親水性，從而提高了其對(duì)疏水性物質(zhì)ZEN的吸附結(jié)合能力，使其不僅吸附AFB1，也吸附ZEN。

3.3 試驗(yàn)方法及毒素檢測(cè)方法等因素的影響

目前考察霉菌毒素脫毒劑脫毒效果的方法主要有：體外吸附法和動(dòng)物體內(nèi)脫毒法。體外吸附法相較于動(dòng)物體內(nèi)脫毒法，更能直觀的反映出各類(lèi)脫毒產(chǎn)品對(duì)各種毒素的具體吸附脫毒效果；但由于大部分脫毒產(chǎn)品選擇吸附性較差，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后易被飼料中的某些營(yíng)養(yǎng)成分所飽和，從而失去了對(duì)毒素的吸附脫毒作用，導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用試驗(yàn)效果與體外脫毒效果差異較大。因此，為了綜合評(píng)價(jià)一種脫毒產(chǎn)品脫毒性能的好壞，必須將體外吸附試驗(yàn)與動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用試驗(yàn)相結(jié)合。霉菌毒素檢測(cè)法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）和高效液相色譜法(HPLC)。HPLC相較于ELISA的優(yōu)點(diǎn)是，其檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠；但缺點(diǎn)是對(duì)操作人員和樣品中毒素純度的要求更高，檢測(cè)成本更高，無(wú)法滿足大批量樣品的快速檢測(cè)篩選；而ELISA法檢測(cè)更快速、靈敏，對(duì)樣品純度要求不高，也適應(yīng)大批量樣品的檢測(cè)，因此本研究中主要采用ELISA法進(jìn)行樣品毒素含量的檢測(cè)。

4 結(jié)論

體外吸附試驗(yàn)結(jié)果表明：10種脫毒劑中除4#、6#和7#三種脫毒劑對(duì)AFB1的吸附脫毒率較低外，其余7種對(duì)AFB1的吸附脫毒效果均較好，吸附脫毒率均在90%以上；10種脫毒劑中10#和6#吸附結(jié)合ZEN的能力較好，吸附脫毒率分別為92%和85%。綜上所述，浙江三鼎科技有限公司生產(chǎn)的改性蒙脫石吸附結(jié)合AFB1和ZEN的能力均較好，且復(fù)合物穩(wěn)定性較強(qiáng)，不易解吸。