參附注射液對腦缺血再灌注大鼠MDA、SOD、TXB2及6-keto-PGF1a的影響及意義

江承平，劉福，李毅，王柏強，唐曉蓉，吳碧華，王曉明

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 63 700 7；2.川北醫(yī)學院神經病學研究所，四川 南充 63 7000）

近年來腦缺血后繼發(fā)性損傷、炎性反應對腦缺血后神經功能缺損及致殘率方面的作用逐漸引起重視。雖然人們更傾向于超早期溶栓治療腦梗死，但是腦缺血再灌注損傷引起的一系列繼發(fā)改變，導致缺血組織損傷惡化。研究發(fā)現(xiàn)，某些中藥如川芎、參附等可以減輕腦缺血再灌注的損傷，但目前國內這方面的具體研究極少。本實驗通過觀察參附注射液對局灶性腦缺血-再灌注大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素 F1a（6-keto-PGF1a）含量的影響，探討參附注射液對腦的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

參附注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司生產，10 mL/支（批號為：991202）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血檢素B2（TXB2）及6-酮-前列腺素Fla（6-keto-PGF1a）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），Amresco 公司；其他試劑均為國產分析純。低溫離心機，美國Beckman TJ-6Centrfuge；TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立：健康雄性成年SD大鼠60只，體質量240～270 g（清潔級）購自川北醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號SCXK（川2008-18）。實驗前置于實驗室適應環(huán)境1周。將大鼠隨機分為假手術組、腦缺血再灌注組（IR組）、參附治療組，每組20只。動物術前12 h禁食不禁水，參照Longa［1］及改良線栓法［2］制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，用2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1腹腔內注射，麻醉后分離頸部各動脈，將直徑0.20 mm尼龍線，自右頸外動脈插入頸內動脈，至遇阻力為止，深度約為18 mm（自頸總動脈分叉處算起），注意防止栓線滑出，結扎固定栓線，術中監(jiān)測直腸溫度，保持在36.5～37.5℃。缺血2 h后，在麻醉狀態(tài)下，拔出栓線，再灌注24 h，以大鼠蘇醒后出現(xiàn)左側Horner征，爬行向左側劃圈或左前肢屈曲為模型建成的標志。假手術組只進行麻醉和血管分離術，不進行缺血再灌注及靜脈注射；參附治療組于再灌注后經靜脈給參附注射液8 mg/kg（生藥濃度），7 d，IR組于再灌注后經靜脈給予生理鹽水 8 mg/kg，7 d。

1.2.2 神經功能缺失評分：按 Longa［1］及 Bederson［3］5分制法對各組動物進行神經功能缺失評分。0分：無神經功能缺失癥狀體征；1分，對側前爪不能完全伸直，同側Horner征；2分，行走時向對側旋轉；3分，行走時向對側傾倒；4分，不能自行行走，意識喪失。

1.2.3 腦梗死面積測定［4］：各組動物實驗結束，迅速斷頭取腦，置于-20℃冰箱中冷凍20 min，距額極后2.5 mm，冠狀面切取腦片5張，將切片迅速置于2%TTC溶液中，避光，37℃溫孵15～30 min，不時翻動切片，使均勻接觸染色劑，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。然后置于4%多聚甲醛中固定，將染色結果輸入計算機，利用圖像處理軟件（AutoCAD），分別計算出5個腦片缺血側的總面積和梗死區(qū)域的面積，求出梗死區(qū)域占大腦半球總面積的百分比作統(tǒng)計參數(shù)。

1.2.4 腦組織 SOD、MDA、TXB2、6-Keto-PGF1a 水平測定：各組動物實驗結束，迅速斷頭取腦，腦組織于冰浴中分離大腦皮層，稱取200 mg，冷PBS液10 mL勻漿，-20℃?zhèn)溆?，測定時樣本作適當稀釋。采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清中SOD活性（單位：U/mL）；硫代巴比妥酸顯色法（TBA法）檢測血清中MDA含量（單位：nmol/L）；平衡法測定TXB2（單位：ng/L）；非平衡法測定6-Keto-PGF1a（單位：ng/L），操作按試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 參附注射液對腦缺血再灌注大鼠神經功能的影響

假手術組的神經功能評分為0，IR組有明顯的神經功能缺失癥狀，主要表現(xiàn)為提尾懸空時的強迫體態(tài)——左前肢緊貼胸壁軀體向左側扭轉，右側肌張力相對增強以及運動時的追尾征——向左側旋轉，致尾巴呈特殊的盤繞狀；參附組能明顯降低模型組神經功能缺失癥狀。見表1。

2.2 參附注射液對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積比的影響

TTC染色結果表明，假手術組腦片均紅染，無白色梗死灶。IR組可見明顯的梗死灶，主要位于嗅溝上方的顳葉皮質和尾殼核。參附治療組與IR組比較腦梗死比顯著下降（P<0.05）。見表1，圖1～3。

2.3 參附注射液對腦缺血再灌注大鼠SOD活性、MDA、TXB2及6-keto-PGF1a含量的影響

IR組與假手術組比較，血清中SOD活性降低，MDA、TXB2含量增加，6-keto-PGF1a含量降低（P<0.05）；參附治療組與IR組比較，血清中SOD活性增高，MDA、TXB2含量降低，6-keto-PGF1a含量增高（P<0.05）；參附治療組血清中SOD活性低于假手術組，MDA、TXB2含量高于假手術組（P<0.05）。見表2。

3 討論

本研究從行為學、形態(tài)學和生物化學等方面證實參附注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

3.1 改善MCAOR損傷后大鼠神經功能缺失癥狀

由于大腦中動脈供血區(qū)涉及調控運動的腦區(qū)，因此動物麻醉清醒后即可表現(xiàn)出運動失調的神經病學癥狀，右側MCAOR，同側調控運動控制區(qū)發(fā)生損傷，由于皮層交叉支配，導致左側肢體肌無力，故運動時向左側旋轉，表現(xiàn)出典型的追尾征或向左側傾倒等癥狀。參附組的大鼠神經功能評分均降低，表明該藥能改善MCAOR大鼠的神經功能障礙。TTC染色結果顯示，參附治療組大鼠腦梗死體積百分比顯著下降，說明參附注射液在減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中起著重要的作用。

3.2 提高SOD的活性，降低MDA含量，維持血漿中TXB2/6-keto-PGF1a動態(tài)平衡

MDA是氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過氧化反應代謝產物，能夠反應細胞損傷的程度［5］，而SOD是天然抗氧化酶，能夠清除體內生成的氧自由基，從而阻斷脂質過氧化連鎖反應，其活性能夠反應機體清除氧自由基的能力。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注后血清中SOD活力顯著下降，MDA含量顯著增高，說明大鼠腦缺血再灌注后大量氧自由基的產生及SOD活力下降引起生物膜脂質過氧化損傷，使MDA含量增高。脂質過氧化增加能夠使細胞溶解，還能引起血小板膜的損傷，促使血小板的聚集，并且會抑制動脈壁前列環(huán)素（PGI2）合成酶活性，使得PGI2合成減少，導致TXA2/PGI2比例失調，引起對機體的損傷［6，7］。PGI2是血管壁內皮細胞合成和釋放的有舒張血管和抗血小板聚集作用的生物活性物質，半衰期短，迅速轉化為穩(wěn)定的無生物活性的6-keto-PGF1a。而TXA2是血小板微粒體合成釋放的具有促進血小板聚集和促進血管收縮的生物活性物質，半衰期也很短，很快轉為穩(wěn)定無生物活性的TXB2。在正常的生理環(huán)境下，PGI2和TXA2保持平衡，控制血管的正常張力，防止血栓的形成。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷時，TXB2（TXA2）增多，6-keto-PGF1a（PGI2）減少，導致血小板聚集和血管強烈收縮，導致低灌流，加重了腦組織的損傷，這與其他報道的結論一致［8，9］。

研究中我們發(fā)現(xiàn)，參附注射液可以顯著提供SOD的活性，使得體內氧自由基減少，減少了氧自由基引發(fā)的脂質過氧化損傷，使MDA含量降低，表明其可減輕缺血所致的腦組織自由基損傷；同時PGI2（6-keto-PGF1a）合成增多，顯著提高TXB2（TXA2）的含量，有利于TXA2/PGI2平衡的恢復，提示參附注射液對腦缺血再灌注的損傷具有顯著的保護作用。

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