HPLC法測定曲奇餅干中丙烯酰胺的含量

王志偉，傅紅，*，楊琳，賴冬花

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003）

2002年瑞典科學(xué)家發(fā)現(xiàn)富含淀粉類食品原料經(jīng)高溫（>120℃）加工后，會產(chǎn)生具神經(jīng)毒素的丙烯酰胺[1]，隨后各國的研究機(jī)構(gòu)均證實(shí)了這個(gè)研究成果[2-3]。2005年4月，我國衛(wèi)生部發(fā)布公告警告公眾關(guān)注食品中的丙烯酰胺，呼吁采取措施減少食品中的丙烯酰胺含量以確保食品的安全性[4]。曲奇餅干由于具備高糖、高油脂、高溫加工的特點(diǎn)，是丙烯酰胺含量較高的食品[5-6]。目前通用的檢測方法包括GC、HPLC、MS及三者之間的結(jié)合技術(shù)[7]。不過，由于食品成分的差異性，特別是針對于油脂和碳水化合物較高的基質(zhì)，丙烯酰胺的快速準(zhǔn)確檢測方法仍然是食品分析工作者面臨的難題。本研究在以往檢測方法的基礎(chǔ)上，通過篩選前處理?xiàng)l件[8-10]，確定了一種有效的曲奇餅干中丙烯酰胺HPLC檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀，配有可變波長檢測器（VWD）：美國 Agilent公司；Mil1i-Q 超純水機(jī)：美國Millipore公司；LG4000-G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：美國Heidolph公司；Oasis HLB，3cc.60mg：美國 Water公司；MG-2200氮吹儀：日本EYELA公司；3-30K高速離心機(jī)：安捷倫科技有限公司；MMV-1000W分液漏斗振動(dòng)器：日本EYELA公司；T25高速分散機(jī)：IKA公司。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸（96%）、甲醇、乙酸乙酯均為色譜純；其他試劑均為國藥分析純。

1.2 方法

1.2.1 曲奇餅干的制作

低筋粉 100 g，白糖 35 g，黃油 50 g，鹽 0.7 g，奶粉5 g，雞蛋 25 g，小蘇打 0.5 g，經(jīng)攪拌、調(diào)粉[11]。每個(gè)面團(tuán)稱取 5 g（精確至 0.01 g），采用特定的模具（7.6×4.6×2.4 cm）壓制成型，然后在190℃條件下烘焙7 min，得到的餅干樣品冷卻后裝入自封袋中，研磨待測。

1.2.2 丙烯酰胺的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg（精確到0.0001 g）丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，二次超純水定容至刻度，得到1 mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，并于4℃冰箱保存。臨用時(shí)配制濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2.2 樣品處理

[10]，稱取2.00 g經(jīng)研磨充分的樣品于100 mL帶蓋聚丙烯離心管中，分別加入（25，250，500μg/kg）丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品以確定方法的加標(biāo)回收率，靜置10 min。加入10 mL正己烷，渦旋混合2 min，棄去上層液（重復(fù)操作一次），電吹風(fēng)吹干。分別加入10 mL 0.1%CHOOH和10 mL 2 mol/L NaCl提取液，均質(zhì)5 min，于50℃水浴中超聲振蕩20 min，10000 r/min，4℃離心20 min。收集上清液于150 mL分液漏斗中，樣品殘?jiān)尤?0 mL 2 mol/L NaCl重復(fù)提取過程，合并上清液，混勻備用。

樣品提取液中加入乙酸乙酯充分萃?。?0 mL×3，振蕩頻率280r/min，10min），合并乙酸乙酯層至150mL梨形瓶，于35℃，真空度150 mbar下減壓濃縮至約1 mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至10 mL玻璃試管中，梨形瓶中加少量乙酸乙酯充分滌蕩3次，合并至試管中，50℃氮?dú)獯蹈桑杆偌尤? mL超純水重溶并渦旋混合。重溶液過0.45μm水系濾膜，再經(jīng)過Oasis HLB萃取小柱（依次用1 mL CH3OH和1 mL超純水活化），棄去前流出液（約7滴～8滴），收集后續(xù)液于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測定。

1.2.2.3 色譜條件

參考文獻(xiàn)[12]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的色譜柱Kromasil ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）確定色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水（5∶95，體積比），流速 0.8 mL/min；檢測波長：210 nm，柱溫 25℃，進(jìn)樣量 5μL。

根據(jù)標(biāo)樣的保留時(shí)間，對樣品所得色譜圖進(jìn)行定性分析。通過色譜儀工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對目標(biāo)物按外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，計(jì)算樣品中丙烯酰胺的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC流動(dòng)相的選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的Kromasil ODS色譜柱，通過改變流動(dòng)相中甲醇的比例，來調(diào)整丙烯酰胺的保留時(shí)間。當(dāng)選用甲醇-水（5∶95,體積比）為流動(dòng)相時(shí)，丙烯酰胺的出峰時(shí)間在5.240 min左右（圖1）。隨后對樣品液進(jìn)行上機(jī)測定，目標(biāo)物能夠很好的與干擾峰實(shí)現(xiàn)分離（圖 2），最終確定流動(dòng)相組成為甲醇-水（5∶95，體積比）。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of acrylamide standard

2.2 線性關(guān)系及檢測限

圖2 樣品中丙烯酰胺檢測色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of acrylamide in sample

以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，由儀器自動(dòng)積分得到線性回歸方程：Y=35.86 X+0.2576，線性系數(shù)為0.99980，在測定范圍內(nèi)（0.2μg/mL～1.0μg/mL）線性關(guān)系性良好。根據(jù)3倍信噪比（S/N），計(jì)算該方法的檢出限為 4.5（ng/mL）；定量限為 14.5（ng/mL）。該范圍覆蓋了大部分食品中丙烯酰胺的含量，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)的分析要求。

2.3 丙烯酰胺提取溫度的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了 25、45、50、55、75 ℃溫度對丙烯酰胺提取效果的影響，結(jié)果見圖3。

隨著溫度的提高，丙烯酰胺的檢測值略有升高，溫度大于50℃時(shí)，檢測值趨于穩(wěn)定；其中50℃時(shí)的檢測值比25℃時(shí)提高了14.9%。同時(shí)，隨著提取溫度的升高，水相與有機(jī)相分層良好，萃取液澄清。最終選擇丙烯酰胺的提取溫度為50℃。

2.4 丙烯酰胺提取料液比的選擇

試驗(yàn)中每克樣品分別用10、15、20 mL提取溶劑（0.1%甲酸∶2 mol/L NaCl溶液=1∶2，體積比），按照1.2.2.2的方法進(jìn)行操作，結(jié)果見圖4。

對于單級提取，提高料液比從10到20對丙烯酰胺得率的影響不顯著；當(dāng)料液比為15時(shí)，采取兩級提取比單級提取的檢測值提高了6.8%，并且獲得最大的檢測值，在節(jié)約成本的同時(shí)，對丙烯酰胺的提取更加充分。實(shí)驗(yàn)確定采用兩次提取，料液比為1∶15（g/mL）。

2.5 乙酸乙酯萃取次數(shù)的選擇

分別采用不同的萃取次數(shù)（1、2、3）對提取液中的丙烯酰胺進(jìn)行乙酸乙酯液液萃取，比較不同萃取次數(shù)對丙烯酰胺檢測值的影響，結(jié)果如圖5所示。

丙烯酰胺的檢測值隨萃取次數(shù)的增加而升高，與1次萃取比較，采用3次萃取能夠使檢測值提高51.6%。這說明充分的萃取可以確保丙烯酰胺最大限度進(jìn)入有機(jī)相中，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，故將萃取次數(shù)確定為3次。

2.6 正交試驗(yàn)

按照（1.2.2.2）方法步驟，選取提取時(shí)間、料液比和萃取次數(shù)為影響因素，各取3個(gè)水平設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（加標(biāo)水平250μg/kg），以回收率為指標(biāo)對丙烯酰胺的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如表1所示。由表1的極差分析可知，以丙烯酰胺的回收率為指標(biāo)時(shí)，各因素對其提取效果的影響程度依次為C>A>B。即乙酸乙酯萃取次數(shù)>提取溫度>料液比，最佳組合C3A2B2，即萃取次數(shù)3次，提取溫度50℃，料液比1∶15，正好是正交表中實(shí)驗(yàn)5，即實(shí)驗(yàn)具有良好可行性，不需做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.7 方法精密度與加標(biāo)回收率

目前國內(nèi)外有關(guān)食品中丙烯酰胺提取的過程，通常是在室溫條件下，以1∶10料液比進(jìn)行單級提取[13-14]，而本研究在提取過程中結(jié)合加熱和二級提取步驟，為了比較兩種提取效果的差異，結(jié)合正交試驗(yàn)的結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)中加分別選取室溫（25℃）、料液比1∶10（g/mL）單級提取、3次萃取操作和提取溫度50℃、料液比1∶15（g/mL）二級提取，3次萃取操作進(jìn)行預(yù)處理。各加標(biāo)水平（25、250、500μg/kg）進(jìn)行 3 次平行測定，以加標(biāo)回收率表示方法的準(zhǔn)確度，RSD表示方法的重復(fù)性和精密度，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of orthogonal experiment

表2 兩種預(yù)處理方法加標(biāo)回收率結(jié)果比較（n=3）Table 2 The comparison of recovery of assay for acrylamide by two pretreated methods(n=3)

3 結(jié)論

本研究建立了一種曲奇餅干中丙烯酰胺的HPLC-VWD檢測方法。通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件，使方法的平均加標(biāo)回收率從86.6%提高到90.9%。該方法可以對樣品中的丙烯酰胺進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量分析，每個(gè)樣品的走樣時(shí)間約為 5 min，在 0.2μg/mL～1.0μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系和重復(fù)性，同時(shí)減少了對昂貴的質(zhì)譜檢測設(shè)備的依賴，使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備價(jià)格相對低廉，容易被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采納，有助于在食品檢測行業(yè)的推廣應(yīng)用。不過，由于食品基質(zhì)之間存在很大的差異性，以后的研究重點(diǎn)仍將集中在復(fù)雜基質(zhì)的預(yù)處理過程。

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