PCR法檢測原料乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A基因型

李荔枝，楊欣，胡萍，*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 安順 561000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA，以下簡稱金葡菌）是引起食品污染和細(xì)菌性食物中毒的主要細(xì)菌病源菌之一，可感染食品并使之腐敗變質(zhì)，部分菌株產(chǎn)生的腸毒素會引起食物中毒。由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的33%，僅次于大腸埃希菌[1]。目前，我國檢測食品中金葡菌常用生化檢測法[2]，檢驗時間較長，需3 d～5 d，且靈敏度較低；采用免疫學(xué)方法如膠微粒凝集試驗、ELISA等,可以縮短檢測時間,但可能受到食物成分及葡萄球菌A蛋白的干擾；采用PCR方法可以快速、靈敏的從食品中檢測出金葡菌[3]。葡萄球菌的致病力是由產(chǎn)生的毒素和酶的能力決定的。目前，除了已發(fā)現(xiàn)的A、B、C（C型又按等電點不同分為 C1、C2、C3）、D、E 共 5 種已被鑒定的血清型外，還有 F、H、I、J、L、M、N 及 TSST-1 共 8 種新型腸毒素。其中A型腸毒素毒力最強，人體攝入1μg/kg即能引起中毒，所以A型腸毒素引起的食物中毒最常見。本實驗以采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）來檢測原料乳中的金黃色葡萄球菌腸毒素A基因型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

金黃色葡萄球菌產(chǎn)A型腸毒素標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13565由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院周碧君教授惠贈；金黃色葡萄球菌產(chǎn)C型腸毒素標(biāo)準(zhǔn)菌株FRI1230由浙江大學(xué)藥學(xué)院陳樞青教授惠贈。

1.1.2 對照菌株

大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、嗜熱鏈球菌、枯草芽孢桿菌由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室提供。

1.1.3 試劑

DP302-02細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：Tiangen Biotech（Bei Jing）CO.,LTD.；Biowest Agarose：Gene Tech（Shang Hai）company limited；Lysozyme：Solarbio；無水乙醇：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；DNA Marker DL2000：恒因生物工程有限公司；PCR引物：上海捷瑞生物工程有限公司合成；Premix：Promega Go TaqR Green Master Mix，2X。

1.1.4 儀器

LT502E電子天平：常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；LDZX－50KBS滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HPX－9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；BCD－206TS海爾電冰箱：青島海爾股份有限公司；DK－98－II電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ－X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設(shè)備廠；G80D23CN1P－G5（SO）格蘭仕微波爐：佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；Gel DocTM XR＋凝膠成像儀：Bio－Rad Laboratories.Inc；LX－100 手掌型離心機：海市市麒麟醫(yī)用儀器廠；S1000TM Thermal Cycler PCR 擴增儀：Bio－Rad Laboratories.Inc；Master－E實驗室超純水機：上海和泰儀器有限公司；潔凈臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；HW－80A漩渦混合機：江蘇省海市市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.1.5 原料

實驗用原料乳采于貴州省貴陽市花溪奶牛場。

1.1.6 引物合成

根據(jù)Genebank公開發(fā)布的nuc基因的核苷酸序列，用primer premier 5.0軟件設(shè)計引物。引物為上海捷瑞生物工程有限公司合成。預(yù)期擴增大小102 bp。

引物序列：SEA-1（5＇-3＇）CGG CAC TTT TTT CTC TTC GG

SEA-2（5＇-3＇）GGT TAT CAA TGT GCG GGT GG 。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

將要提取的金黃色葡萄球菌于LB液體培養(yǎng)基中過夜增菌培養(yǎng)。取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液1000 r/min離心，收集菌體，加 180μL 溶菌酶（50 mg/mL）破壁處理，提取方法參照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.2 原料乳中DNA提取

取適量原料乳1 mL，分別加入200μL無水乙醇、200μL石油醚（或乙醚）、200μL丙酮，充分混勻。將混合物以12000r/min離心10min，棄上清液。再將沉淀用300μL TE（pH8.0）溶解，加 180μL 溶菌酶（50 mg/mL）破壁處理，提取方法參照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.3 PCR反應(yīng)

1.2.3.1 PCR擴增條件優(yōu)化

PCR擴增條件的優(yōu)化主要為退火溫度的選擇。nuc基因的退火溫度選擇范圍52℃～60℃。同時選擇合適的模板濃度及引物濃度。

1.2.3.2 PCR反應(yīng)體系

在Eppendorf管中添加下列擴增反應(yīng)液：Premix 10μL，引物 1 和引物 2 各 0.4μL，模板 1μL，加無菌雙蒸水補足至20μL。

1.2.3.3 PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行。預(yù)變性：94℃，5 min；變性：94 ℃，45 s；退火：52～60 ℃，35 s；延伸：72 ℃，45 s；共30個循環(huán)。最后72℃延伸7 min。

1.2.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取PCR擴增產(chǎn)物6μL加入濃度1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，同時加入2000 bp的Marker作為標(biāo)準(zhǔn),電壓80 V，時間60 min左右，利用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析與鑒定。同時對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.2.4 PCR擴增反應(yīng)特異性檢測

以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、志賀氏菌、沙門氏菌的基因組DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。采用1.2.3.2的反應(yīng)體系以及1.2.3.3中優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴增。

1.2.5 PCR擴增反應(yīng)靈敏性檢測[4]

將試劑盒提取的基因組DNA，用無菌雙蒸水按十倍系列稀釋法稀釋至10-8，取每個稀釋度作為模板進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素A基因的PCR擴增

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，采用已設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR擴增并進(jìn)行退火溫度優(yōu)化實驗，根據(jù)設(shè)計SEA引物時的退火溫度范圍，選擇52℃～60℃進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，從高到低分別為 60.0、59.6、58.7、57.1、55.2、53.6、52.5、52.0 ℃。結(jié)果能擴出大小約為102 bp的特異性DNA條帶，結(jié)果如圖1。SEA基因的PCR擴增在退火溫度52℃～60℃范圍內(nèi)擴增效果較好，但退火溫度在59.6℃、58.7℃和

圖1 SEA基因片段擴增產(chǎn)物及退火溫度優(yōu)化Fig.1 The genetic sequences product expansion of SEA andannealing temperature optimization

53.6 ℃時擴增效果較為理想。但退火溫度過高或過低都會對反應(yīng)體系造成一定的影響，所以最終選定58.7℃為最佳退火溫度。

2.2 金黃色葡萄球菌腸毒素A基因PCR特異性檢測

以攜帶SEA基因的ATCC-13565標(biāo)準(zhǔn)菌株、未攜帶SEA基因的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、志賀氏菌、沙門氏菌將建立好的方法進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果如圖2。

圖2 SEA基因PCR特異性性檢測結(jié)果Fig.2 The specific results of SEA genes of PCR test

只有攜帶SEA基因的ATCC-13565標(biāo)準(zhǔn)菌株擴增出與預(yù)期大?。?02 bp）相一致的片段，而未攜帶SEA基因的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、志賀氏菌、沙門氏菌擴增結(jié)果為陰性，結(jié)果如圖2。表明用SEA-1/SEA-2引物進(jìn)行的PCR檢測具有較高的特異性。

2.3 金黃色葡萄球菌腸毒素A基因PCR靈敏性檢測

將ATCC-13565的基因組用無菌雙蒸水進(jìn)行十倍系列稀釋至10-8，取每一個稀釋度作為模板進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果如圖3。

圖3 SEA基因PCR靈敏性檢測結(jié)果Fig.3 The specific results of SEA genes of PCR test

當(dāng)稀釋度為10-5時仍可看見清晰的擴增條帶，即PCR法檢測原料乳中的金黃色葡萄球菌A型基因的靈敏度為 1.357 pg/μL。

2.4 原料乳中SEA基因的PCR檢測

對采集于奶牛場的乳樣進(jìn)行檢測，分別標(biāo)號為a、b、c、d、e、f、g、h。其中 a、b、c為乳房炎乳樣，d、e、f、g 是隨機抽取奶牛的乳樣，h是牛乳倒入冷卻罐后的綜合樣。檢測結(jié)果如圖4。

圖4 PCR法檢測原料乳中的SEA結(jié)果Fig.4 The results of PCR method to detect SEA in the raw milk

結(jié)果顯示只有乳房炎乳樣檢測出SEA，綜合乳樣及隨機抽取的乳樣均未檢出SEA，初步判定乳房炎是由SEA引起的。

3 討論

金葡菌是引起人類常見見感染的主要病原菌之一[5]，同時也是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一[6]，其產(chǎn)生的毒素更是能在引起各種慢性疾病的發(fā)生[7]。已發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌的腸毒素中，A型腸毒素的致病性最強[8]，引起的食物中毒最常見[9]。本實驗通過建立PCR方法來檢測原料乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A基因型，優(yōu)化其退火溫度并驗證了其敏感性、特異性。結(jié)果表明此方法在退火溫度為58.7℃時擴增效果較為理想；PCR擴增的靈敏度為1.357 pg/μL；分別以未攜帶SEA基因的金葡菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、志賀氏菌、沙門氏菌的基因組DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，結(jié)果為陰性。同時對采集的乳樣進(jìn)行檢測，乳房炎乳樣中檢測出了金葡菌腸毒素A基因，正常乳中沒有檢測出金葡菌，初步判斷乳房炎是由金葡菌引起的。

由于PCR檢測靈敏度高，少量的DNA模板即可檢測出結(jié)果。但如果得到的模板越多，由交叉引起的錯誤結(jié)果的可能性越大。因此，一般采用增菌和提取樣本DNA來提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。但這無疑又延長了檢測的時間。而且每次提取DNA前都需要增菌，偶爾也能擴增出已死亡的金葡菌的DNA，造成假陽性進(jìn)而影響實驗結(jié)果。這些都是PCR法檢測金葡菌在今后發(fā)展發(fā)展過程中要克服的問題。

實驗建立的PCR檢測金葡菌方法與傳統(tǒng)檢測方法相比，避免了費時的培養(yǎng)過程，而且PCR的操作具有簡便性好、特異性強、敏感性高的特點，因而適用于食品、醫(yī)療等方面的檢測。而且隨著科學(xué)的進(jìn)步，相信PCR技術(shù)會更加完善。

4 結(jié)論

本實驗通過對原料乳中金葡菌檢測方法的研究，得出了以下結(jié)論：

1）最佳反應(yīng)體系：Premix 10μL，引物 1和引物 2各 0.4μL，模板 1μL，加無菌雙蒸水補足至 20μL。

2）最佳退火溫度：58.7℃。

3）除了含有SEA的菌株在102 bp處成功擴增處條帶外，其余對照菌株均為陰性。即已建立的PCR擴增反應(yīng)特異性良好。

4）將ATCC-13565的基因組用無菌雙蒸水進(jìn)行十倍系列稀釋至10-8，取每一個稀釋度作為模板進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果顯示當(dāng)稀釋度為10-5時仍可看見清晰的擴增條帶，即PCR法檢測原料乳中的金黃色葡萄球菌A型基因的靈敏度為1.357 pg/uL。

5）在奶牛場采集原料乳樣共8份，其中3份為乳房炎乳樣，4份為正常乳樣，一份是綜合乳樣。結(jié)果顯示只有乳房炎乳樣檢測出SEA，綜合乳樣及隨機抽取的乳樣均未檢出SEA，初步判定乳房炎是由SEA引起的。

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