復(fù)方三七納米顆粒對顱腦損傷大鼠TNF－α、IL－2及IL－6的影響*

張 富，楊國強，田愛林

(河北省唐山市玉田縣醫(yī)院，河北玉田 064100)

顱腦損傷可以導(dǎo)致患者體內(nèi)細(xì)胞因子水平失衡，并可使炎癥反應(yīng)持續(xù)放大，影響血腦屏障的穩(wěn)定性。目前有研究證實［1］活血化瘀藥物可以透過血腦屏障，擴張腦血管，改善腦血流，加快顱內(nèi)血腫的吸收和腦水腫的消除，維護(hù)腦損傷時血腦屏障的結(jié)構(gòu)完整，改善其功能。筆者在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)復(fù)方三七納米顆粒佐治顱腦損傷患者有很好的治療效果，并在前期動物實驗中發(fā)現(xiàn):復(fù)方三七納米顆粒可改善顱腦損傷大鼠認(rèn)知功能及延長生存時間，同時發(fā)現(xiàn)該藥具有抗血栓形成，且不增加出血風(fēng)險的作用。為進(jìn)一步探討復(fù)方三七納米顆粒治療顱腦損傷作用機制，我們復(fù)制了顱腦損傷大鼠模型，并在此模型基礎(chǔ)上觀察復(fù)方三七納米顆粒劑對顱腦損傷大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠96只，體重200～220g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;動物等級:一級;合格證:712101。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方三七納米顆粒 (中藥配方顆粒廣東一方制藥有限公司，批號0708001);尼莫地平片 (拜耳醫(yī)藥保健品有限公司，國藥準(zhǔn)字H20003010);TNF-α、IL-2、IL-6放射免疫試劑盒由北京科美東雅生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 模型制備［2］

實驗前大鼠禁食12h，飲水自由。將大鼠稱重麻醉后固定于解剖臺上，剪去大鼠頭頂部毛發(fā)，消毒后于矢狀正中切開頭皮，剝離骨膜，暴露左側(cè)頂骨，在冠狀縫后1.5mm，中線旁左側(cè)2.5mm處，用牙科鉆鉆1個小孔，并擴大為直徑5mm的骨窗，保持硬腦膜完整;將一圓形鋼板墊 (直徑約4.5mm，厚度3.5mm)置于硬膜外，用50g擊錘從20cm高處沿套管呈自由落體沖擊于致傷墊，造成頂葉局部性腦挫裂傷，打擊后，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，致傷動物蘇醒后原籠喂養(yǎng)。

1.4 分組及給藥

將96只大鼠隨機分為假手術(shù)組、創(chuàng)傷模型組、復(fù)方三七納米顆粒劑組和尼莫地平組，每組各24只，建立顱腦損傷動物模型，假手術(shù)組給予假手術(shù)處理。假手術(shù)組給予生理鹽水2mL灌胃，創(chuàng)傷模型組給予生理鹽水2mL灌胃，復(fù)方三七納米顆粒組按復(fù)方三七納米顆粒1.33g·kg-1相當(dāng)于生藥量2.4g·kg-1制成水溶液2mL灌胃，尼莫地平組每只大鼠每天100g體重0.1mg尼莫地平片 (制成水溶液)灌胃2mL。

1.5 取材及指標(biāo)檢測

分別于造模后第1、3、5d，2%戊巴比妥鈉(上海西唐生物技術(shù)有限公司提供)腹腔麻醉(3mL/kg)，迅速從大鼠腹主動脈取血5mL待測TNF-α、IL-2、IL-6，TNF-α、IL-2、IL-6量測定采用放射免疫法，具體實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均輸入數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 各組大鼠治療前后血清TNF－α含量 ±s)

表1 各組大鼠治療前后血清TNF－α含量 ±s)

△P＜0.05與假手術(shù)組相比;*P＜0.05與模型組相比;＊＊P＜0.01與模型組相比;▲P＜0.05與尼莫地平組相比

分組 n/只傷后1d(n=8只)TNF-α/(ng/mL)傷后3d(n=8只)TNF-α/(ng/mL)傷后5d(n=8只)TNF-α(ng/mL)假手術(shù)組24 0.92±0.23 1.03±0.29 1.05±0.31模型組 24 1.98±0.36△ 2.87±0.41△ 2.13±0.40△尼莫地平組 24 1.48±0.50* 1.93±0.51* 1.66±0.47*復(fù)方三七納米顆粒劑組 24 1.13±0.47＊＊▲ 1.19±0.45＊＊▲ 1.07±0.43＊＊▲

與假手術(shù)組相比，模型組各時間點內(nèi)TNF-α含量均有明顯升高，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05);與模型組相比，尼莫地平組各時間點內(nèi)TNF-α含量均下降，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，復(fù)方三七納米顆粒劑組各時間點內(nèi)TNF-α含量均下降，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);與尼莫地平組相比，復(fù)方三七納米顆粒劑組各時間點TNF-α含量均下降，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)。

表2 各組大鼠治療前后血清IL－6含量 ±s)

表2 各組大鼠治療前后血清IL－6含量 ±s)

△△P＜0.01與假手術(shù)組相比;*P＜0.05與模型組相比;＊＊P＜0.01與模型組相比;▲P＜0.05與尼莫地平組相比

分組 n/只傷后1d(n=8只)IL-6/(ng/mL)傷后3d(n=8只)IL-6/(ng/mL)傷后5d(n=8只)IL-6(ng/mL)假手術(shù)組24 32.07±9.04 32.91±9.04 32.07±9.32模型組 24 66.89±13.17△△ 71.09±13.41△△ 69.39±12.36△△尼莫地平組 24 48.94±13.27* 42.93±13.77* 41.86±13.07*復(fù)方三七納米顆粒劑組 24 36.28±11.75＊＊▲ 35.38±12.87＊＊▲ 34.13±12.09＊＊▲

與假手術(shù)組相比，模型組各時間點內(nèi)IL-6含量均有明顯升高，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05);與模型組相比，尼莫地平組各時間點內(nèi)IL-6含量均下降，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)，復(fù)方三七納米顆粒劑組各時間點內(nèi)IL-6含量均下降，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.01);與尼莫地平組相比，復(fù)方三七納米顆粒劑組各時間點IL-6含量均下降，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)。

表3 各組大鼠治療前后血清IL－2含量 (±s)

表3 各組大鼠治療前后血清IL－2含量 (±s)

△△P＜0.01與假手術(shù)組相比;*P＜0.05與模型組相比;＊＊P＜0.01與模型組相比;▲P＜0.05與尼莫地平組相比

分組 n/只傷后1d(n=8只)IL-2/(ng/mL)傷后3d(n=8只)IL-2/(ng/mL)傷后5d(n=8只)IL-2(ng/mL)假手術(shù)組24 5.94±0.81 6.03±0.76 6.85±0.78模型組 24 3.08±0.63△△ 3.26±0.71△△ 3.73±0.70△△尼莫地平組 24 4.89±0.83* 5.17±0.82* 5.53±0.79*復(fù)方三七納米顆粒劑組 24 5.56±0.74＊＊▲ 5.96±0.79＊＊▲ 6.65±0.80＊＊▲

與假手術(shù)組相比，模型組各時間點內(nèi)IL-2含量均有明顯下降，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.01);與模型組相比，尼莫地平組各時間點內(nèi)IL-2含量均升高，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)，復(fù)方三七納米顆粒劑組各時間點內(nèi)IL-2含量均升高，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.01);與尼莫地平組相比，復(fù)方三七納米顆粒劑組各時間點IL-2含量均升高，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)。

3 結(jié)論

顱腦損傷后，各種原因激活中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生多種炎癥遞質(zhì)。研究表明［3］，TNF-α和IL-6等的大量生成促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集和激活，導(dǎo)致腦血管結(jié)構(gòu)和血腦屏障的破壞，使局部血管擴張、通透性增加，補體、急性期蛋白等隨血漿外滲，從而進(jìn)一步加劇顱腦損害的發(fā)生。TNF-α能介導(dǎo)IL-2及IL-6的產(chǎn)生，并通過這些介質(zhì)影響幾乎所有的免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)和組織損傷［4］。IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在顱腦損傷中扮演著重要角色，Mark-lund［5］認(rèn)為IL-6在損傷發(fā)生后即刻就上升，而且損傷程度越重，血中IL-6的水平越高。有研究發(fā)現(xiàn)［6］人類的中性粒細(xì)胞浸潤發(fā)生在腦出血后5～72h，滲出的中性粒細(xì)胞能夠釋放各種細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6等，加重腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)［7］，顱腦損傷后IL-2處于抑制狀態(tài)，且在7d內(nèi)均處于低水平表達(dá)，但I(xiàn)L-2濃度隨時間延長其含量持續(xù)升高，且IL-2和IL-6同樣是患者傷情輕重的表現(xiàn)之一。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有述:“若有所墮墜，惡血留內(nèi)”，顱腦損傷發(fā)生病理基礎(chǔ)為外傷致腦中蓄血，屬中醫(yī)學(xué)中“巔頂骨折、血瘀、血證”之“實證”范疇，治療上應(yīng)注重活血化瘀，如瘀血留于腦內(nèi)不去則重生變故，《重訂廣溫?zé)嵴摗吩?“蓋以腦為元神之府，心為藏神之臟，但為瘀熱所蔽，血毒所攻，則心靈有時而昏，甚至昏狂、昏顛、昏閉、昏痙、昏厥，而全不省人事矣”。復(fù)方三七納米顆粒主要取材于五加科人參屬植物三七的根莖，三七是經(jīng)典的活血化瘀良藥， 《玉揪藥解》中指出本品可:和營止血，通脈行瘀，行瘀血而斂新血，其中所含的主要成分為三七總苷，三七總苷對大鼠的炎癥有明顯的對抗作用，并能對抗緩激肽、組織胺、5-羥色胺等所致毛細(xì)血管通透性增加及炎癥組織前列腺素的釋放［8］。且復(fù)方三七納米顆粒制作過程中采用表面化學(xué)方法對三七納米藥粒表面進(jìn)行修飾，提高其靶向能力，控制藥物在體內(nèi)的分布與釋放，同時增加其親水親油性，提高三七的生物有效性、靶向性和疾病治療的特異性。本實驗結(jié)果表明:顱腦損傷后大鼠第一天血清中TNF-α、IL-6含量較假手術(shù)組明顯升高，2d內(nèi)持續(xù)升高，5d時開始下降，血清中二者濃度呈相關(guān)性，這表明顱腦損傷后促炎細(xì)胞因子表達(dá)活躍，且在5d內(nèi)呈持續(xù)擴大狀態(tài)，加重顱腦損傷;IL-2含量較假手術(shù)組明顯降低，且5d內(nèi)均處于低水平表達(dá);復(fù)方三七納米顆粒可降低顱腦損傷大鼠血清各時間點的TNF-α、IL-6的含量，增加IL-2的表達(dá)，考慮與前期研究中發(fā)現(xiàn)的復(fù)方三七納米顆粒對抗去甲腎上腺素收縮腦血管，增加腦血流量，改善腦水腫有關(guān)。

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