生大黃聯(lián)合培菲康對重癥急性胰腺炎大鼠的早期保護作用*

余炳取 賈 杰 張益光 吳炳權(quán) 孟凡升 鄭娟紅

（浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

急性胰腺炎 （AP）時常伴有血清細胞因子和炎性介質(zhì)的升高，且升高幅度與急性胰腺炎嚴重程度呈正比，能導致全身炎癥反應綜合征（SIRS）和多器官功能衰竭（MOSF）。腸道細菌和內(nèi)毒素的移居參與了ANP繼發(fā)感染和SIRS的發(fā)生，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)變化應有利于控制腸道細菌和毒素的移居，對AP起到保護作用，但其具體作用機制尚不明確。本研究探討生大黃聯(lián)合微生態(tài)制劑對重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）及其胰腺病理組織學改變的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 健康清潔級SD大鼠64只，雌雄不分，體質(zhì)量180～220 g，由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

1.2 試藥與儀器 生大黃 （三九醫(yī)藥），培菲康 （上海信誼藥廠）。左旋精氨酸（Sigma公司），TNF-α、IL-10放射免疫分析試劑盒（bender公司），DFM-96型多管放射免疫計數(shù)管（聯(lián)機）（合肥眾成機電技術公司）。

1.3 分組及造模 將大鼠隨機分為正常對照組，模型組，生大黃組，生大黃聯(lián)合培菲康組（聯(lián)合組），每組16只。大鼠術前12 h禁食不禁水，用10%左旋精氨酸溶液按1 g/kg腹腔注射制作SAP大鼠模型，術后禁食不進水。模型組和治療組全部造模成功。

1.4 給藥 正常對照組及模型組大鼠于術后3 h后予0.85%氯化鈉灌胃（1 mL/100 g體質(zhì)量）；生大黃組在造模3 h后胃管注入（1 mL/100 g體質(zhì)量）中藥液1次；聯(lián)合組在造模3 h后胃管注入中藥液基礎上同時加培菲康溶液灌胃，1×107CFU/d。

1.5 標本采集及檢測 各組灌胃均12 h 1次，并于12、24、48、72 h分批處死。（1）將大鼠麻醉后于腹主動脈采血2 mL，在室溫下離心（2500 r/min，10 min），取血清在-20℃保存，血清 TNF-α、IL-10水平用ELISA方法檢測，按說明書要求操作。（2）取部分新鮮胰腺組織，用濾紙拭除血跡后稱濕質(zhì)量，后置于60℃烤箱內(nèi)烘烤48 h，稱干質(zhì)量，以胰腺濕/干質(zhì)量比反映胰腺水腫程度。按Rongione［1］的評分標準以水腫、炎癥、出血和壞死評價胰腺組織損傷的程度，各項最低分為0分，最高分為4分，取各項積分之和評價胰腺的病理組織學改變。（3）并取2塊新鮮胰腺組織標本用10%甲醛固定，石蠟包埋行HE染色，觀察胰腺的病理改變，每張切片觀察20個視野。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，以單因數(shù)方差分析對各組均數(shù)進行顯著性檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清TNF-α、IL-10水平的比較 見表1。與正常對照組相比，模型組大鼠血清TNF-α水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），生大黃組和聯(lián)合組大鼠血清TNF-α水平低于模型組，但差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組相比，模型組大鼠血清IL-10水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；生大黃組血清IL-10水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且聯(lián)合組明顯高于生大黃組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組血清TNF-α、IL-10水平及胰腺濕/干質(zhì)量比比較（）

表1 各組血清TNF-α、IL-10水平及胰腺濕/干質(zhì)量比比較（）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)合組比較，△P＜0.05。下同。

n TNF-α（ng／L）16 238.26±26.82**模型組 46.03±11.00 0.78±0.09組 別 IL-10（ng／L） 胰腺濕/干質(zhì)量比正常對照組 35.64±2.30* 0.60±0.15*16 274.96±18.87生大黃組 16 260.35±17.61 34.89±9.12**△ 0.61±0.17*聯(lián)合組 16 261.33±31.50 43.56±6.22 0.70±0.05*

2.2 各組胰腺濕/干質(zhì)量比 與正常對照組相比，模型組、生大黃組和聯(lián)合組大鼠胰腺濕/干質(zhì)量比均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而生大黃組和聯(lián)合組明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組胰腺病理組織學改變及評分 肉眼觀察，正常對照組胰腺外觀正常；模型組可見胰腺質(zhì)地偏硬，大網(wǎng)膜、腸系膜及腎脂肪囊可見皂化斑，胰腺與周圍組織粘連，可見水腫、出血和壞死灶，腹腔有中量血性腹水；治療組大鼠胰腺腫脹明顯，質(zhì)地尚軟，部分可見黃色壞死灶，腹腔有少量血性腹水。顯微鏡下：正常對照組胰腺組織正常；模型組胰腺腺泡小葉結(jié)構(gòu)嚴重破壞，小葉間隙增大，可見小葉分隔，胰腺組織大片出血、凝固性壞死及脂肪壞死，可見血管破裂出血，壞死區(qū)見大量中性粒細胞和單核細胞浸潤，符合重癥胰腺炎病理改變；生大黃組和聯(lián)合組較模型組炎癥明顯減輕，表現(xiàn)為胰腺間質(zhì)水腫仍明顯，小葉間隙增大，可見小葉分隔，伴中量至大量炎性細胞浸潤，腺泡腫脹，胰腺組織壞死范圍縮小，可見凝固性或脂肪壞死，其中聯(lián)合組炎癥減輕更明顯。見圖1。各組胰腺組織病理學評分見表2。

3 討 論

圖1 各組胰腺病理組織學切片（HE，×400）

表2 各組胰腺組織病理評分值（分，）

表2 各組胰腺組織病理評分值（分，）

炎癥 出血0** 0**模型組壞死 積分正常對照組 0** 0**組 別 水腫0**3.61±0.52 3.61±0.52 1.93±0.52生大黃組 3.34±0.52* 2.15±0.62* 1.38±0.52* 1.62±0.52* 8.49±0.68*聯(lián)合組 3.14±0.52* 2.01±0.60* 1.25±0.52* 1.52±0.52* 7.94±0.58*21.62±0.52 11.23±1.40

SAP是一種伴有全身多器官功能障礙的疾病，起病急驟，病情危重，并發(fā)癥多。IL-10是機體內(nèi)諸多抗炎細胞因子中最重要的多功能調(diào)節(jié)因子，有利于促炎?？寡准毎蜃悠胶夂脱装Y的恢復，是目前所發(fā)現(xiàn)的AP時重要的強效抗炎細胞因子，在阻止胰腺持續(xù)壞死，AP的早期診斷、治療及預防中均起到了關鍵的作用［2］。隨著研究的不斷深入，國內(nèi)外學者更加注重保護機體防御功能和調(diào)節(jié)機體適度反應在抗感染治療中的地位。近年來臨床觀察和實驗研究結(jié)果表明，腸道細菌和內(nèi)毒素的移居參與了ANP繼發(fā)感染和SIRS的發(fā)生，其主要的原因為腸黏膜的損傷和腸道細菌過度繁殖所造成的菌群紊亂、腸道動力紊亂、細胞因子過度生長、生長因子缺乏和腸黏膜上皮細胞過度凋亡而致使腸黏膜屏障損傷，發(fā)生腸道衰竭。因此調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)變化應有利于控制腸道細菌和毒素的移居。

中醫(yī)學認為AP病機為氣滯濕阻、瘀凝不通、郁久化熱、濕熱搏阻中焦，以理氣攻下、清熱解毒為治則，運用生大黃等中藥用于治療SAP已成為我國獨有的SAP綜合治療的重要組成部分，但其具體作用機制尚不明確。有學者認為［3］，生大黃抑制胰酶活性，抑制巨噬細胞過度激活及中性粒細胞浸潤，減少炎性細胞因子及自由基的釋放，還抑制血管通透性，松弛膽道口括約肌，維護腸管屏障功能，免除腸菌移位；可有效改善大鼠急性出血性胰腺炎的嚴重程度。

培菲康即雙歧桿菌、嗜乳酸桿菌和腸球菌三聯(lián)活菌，服用后分別定植在腸道的上、中、下部位，組成了一個在不同條件下都能生長、作用快而持久的聯(lián)合菌群，在整個腸道黏膜表面形成一道生物屏障，防止致病菌侵襲，抑制有害菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素和致癌物質(zhì)。給藥后，通過重建宿主腸道菌群間的微生態(tài)平衡，抑制場內(nèi)有害菌及其產(chǎn)生的各種有害物質(zhì)，清除自由基及過氧化脂質(zhì)。陳磊等［4］ANP豬模型表明早期腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)能有效減輕內(nèi)毒素血癥，降低NF-κB活性及細胞因子濃度，維持促抗炎反應平衡。腸內(nèi)免疫微生態(tài)［5］營養(yǎng)，可以補充腸道正常菌群，減少細菌易位，減少內(nèi)毒素血癥及炎癥因子的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清TNF-α、IL-10水平顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。生大黃治療組和聯(lián)合治療組可以降低SAP大鼠血清TNF-α水平，并減輕胰腺濕/干質(zhì)量比，其胰腺炎性細胞浸潤、出血、壞死等病理組織學改變均明顯減輕，且在胰腺濕/干質(zhì)量比和胰腺組織病理積分上差異具有統(tǒng)計學意義。其中兩個治療組的SAP大鼠血清TNF-α水平與模型組有降低，但差異不具有統(tǒng)計學意義，考慮與實驗大鼠數(shù)量偏少有關，有待進一步研究。生大黃組和聯(lián)合組均降低SAP大鼠血清IL-10水平，其中聯(lián)合治療組SAP大鼠血清IL-10水平明顯高于生大黃組，差異具有統(tǒng)計學意義。這表明生大黃和培菲康可以減輕SAP大鼠胰腺的組織病理學改變并降低血清炎性介質(zhì)TNF-α、IL-10的水平，阻止全身病情加重，其中聯(lián)合治療組中的培菲康可以促進機體產(chǎn)生內(nèi)源性的IL-10，提升血清IL-10的水平，對AP的早期治療及預防中均起到了關鍵的作用。

生大黃聯(lián)合微生態(tài)制劑治療SAP的作用結(jié)果可能為保護和重建腸屏障功能，促進腸道功能早期恢復，重建促抗炎細胞因子的平衡，進而減輕SAP的炎癥反應，將有利于降低SAP死亡率。

［1］Rongione AJ，Kusske AM，Kwan K，et al.Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rats［J］.Gastroenterology，1997，112：960-967.

［2］王剛，孫備.白介素10在急性胰腺炎中的應用現(xiàn)狀［J］.世界華人消化雜志，2005，13（1）：69-71。

［3］劉曉紅，趙零卿，錢家鳴.大黃對大鼠急性出血性胰腺炎的影響［J］.中華消化雜志，2004，24（1）：14-17。

［4］陳磊，鄒曉平，田覓，等.腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)對急性壞死性胰腺炎全身炎癥反應影響的研究［J］.中華胰腺病雜志，2008，8（2）115-118.

［5］白黎智.腸內(nèi)免疫微生態(tài)營養(yǎng)對重癥急性胰腺炎肝損害的影響［J］.世界華人消化雜志 2010，18（6）：616-620.