針刺對(duì)戊四唑致癇大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響*

昂文平 楊 帆 沈德凱 劉向國

（安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230038）

癲癇是一組由不同病因所引起的腦神經(jīng)元高度同步化異常放電所致。癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致腦神經(jīng)元損傷，甚至死亡［1］。我們以往的研究表明針刺具有明顯的抗癲癇作用［2］。近來，臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明針灸對(duì)中風(fēng)病具有很好的腦神經(jīng)元保護(hù)作用［3］。為此，本實(shí)驗(yàn)通過建立戊四唑誘發(fā)大鼠癲癇模型，給予針刺治療，通過HE染色和電鏡觀察癲癇大鼠海馬區(qū)病理改變及神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化，探討針刺對(duì)大鼠癲癇發(fā)作繼發(fā)腦神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康SD大鼠72只（安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第070211號(hào)），體質(zhì)量約300 g。隨機(jī)分為3組：模型組、針刺組、正常組，每組24只，分別于癲癇發(fā)作后4 h與24 h兩個(gè)時(shí)間段取材，每個(gè)時(shí)間段取12只大鼠，其中6只用4%多聚甲醛內(nèi)固定后取腦用于制作石蠟切片；另6只大鼠取活體海馬組織作電鏡觀察。

1.2 藥物與試劑 戊四唑，美國Sigma公司產(chǎn)品，用前以0.9%氯化鈉注射液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模型制備［4］采用戊四唑50 mg/kg腹腔注射造成急性癲癇發(fā)作模型。正常組大鼠腹腔注射2 mL 0.9%氯化鈉注射液。

1.4 針刺方法 將大鼠放置在特制的高臺(tái)上，選用1寸28號(hào)毫針，針刺百會(huì)、大椎穴［5］，每5分鐘以左右捻轉(zhuǎn)手法行針1次，30 min后取針，結(jié)束治療。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) （1）大鼠經(jīng)10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射深度麻醉，待翻正反射消失以后，按常規(guī)方法4%多聚甲醛左心灌注固定取腦。用刀片切去小腦并于視交叉前切去大腦，置入上述相同固定液中固定24 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，于海馬部位制成厚約5μm的石蠟切片，HE染色，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。（2）取活體大鼠海馬組織CA3區(qū)1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛4～6 h后，將組織固定于1%鋨酸1 h，30%、50%乙醇脫水后放入70%醋酸鈾乙醇飽和液中12 h，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，表于銅網(wǎng)上，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染液，透射電鏡觀察并攝片。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 正常大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，光鏡下觀察，胞漿透明，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核居中，大而圓，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，形態(tài)正常，核周間隙正常。模型組大鼠癲癇發(fā)作4 h后，海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞呈散在的細(xì)胞變性水腫，輪廓模糊、界限不清，細(xì)胞間距加大，錐體細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，出現(xiàn)較多受損的異常神經(jīng)元，海馬結(jié)構(gòu)失去完整，并見散在的深染、核固縮神經(jīng)元，CA1區(qū)見少量神經(jīng)元壞死、錐體細(xì)胞排列不整齊但程度較CA3區(qū)輕。癲癇發(fā)作24 h后，海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細(xì)胞層神經(jīng)元稀疏，排列紊亂，神經(jīng)元形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹或皺縮、輪廓模糊、界限不清，細(xì)胞間距加大。見圖1。

圖1 模型組4、24 h腦組織海馬切片（HE染色，×400）

針刺組在癲癇發(fā)作4 h大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元較稠密，排列整齊，細(xì)胞有輕度水腫，細(xì)胞間距變化不明顯，受損的異常神經(jīng)元均較少；癲癇發(fā)作24 h大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元排列尚整齊，水腫、固縮不明顯，僅散在少量的變性壞死神經(jīng)元。見圖2。

圖2 針刺組4、24 h腦組織海馬切片（HE染色，×400）

2.2 海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察 電鏡下可見正常組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)正常，核呈橢圓形，核膜完整清晰，染色質(zhì)分布均勻，常染色質(zhì)豐富，核仁較明顯，呈海綿狀，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體、高爾基體，核糖體均較發(fā)達(dá)，線粒體結(jié)構(gòu)清晰完整。

模型組癲癇發(fā)作4 h后大鼠海馬神經(jīng)元即出現(xiàn)損傷，超微結(jié)構(gòu)觀察核膜不清晰，部分神經(jīng)元表現(xiàn)為核固縮，線粒體膜不完整，斷裂；24 h后海馬神經(jīng)元損傷加重，神經(jīng)元核膜不清晰，核固縮，染色質(zhì)邊集，線粒體膜斷裂，基質(zhì)消失，出現(xiàn)明顯空泡化，伴內(nèi)外膜的崩解，出現(xiàn)巨大線粒體，并有髓樣小體形成，部分膠質(zhì)細(xì)胞空化、腫脹，細(xì)胞器稀疏，結(jié)構(gòu)破壞，高爾基復(fù)合體囊泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，并觀察到凋亡細(xì)胞。見圖3。

圖3 模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元電鏡圖

針刺組大鼠海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕，其中4 h時(shí)間段神經(jīng)元出現(xiàn)核膜較完整，異染色質(zhì)稍增多，線粒體輕微腫脹；24 h時(shí)間段神經(jīng)元核膜完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富、增寬不明顯，線粒體結(jié)構(gòu)正常。見圖4。

圖4 針刺組大鼠海馬CA3區(qū)電鏡圖

3 討 論

研究顯示一次癲癇的急性發(fā)作就足以引起邊緣葉特定區(qū)域神經(jīng)元的脫失［6-7］，由于癲癇的病程具有慢性和反復(fù)性的特點(diǎn)，因此上述病理損害會(huì)重復(fù)發(fā)生并不斷疊加。近年來對(duì)癲癇造成的腦損害研究成為重要的研究課題，臨床、病理和神經(jīng)影像學(xué)都揭示了癲癇持續(xù)狀態(tài)可以造成嚴(yán)重的腦損害，尤其是海馬區(qū)的硬化，并直接導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作［8］。本研究利用HE染色和電子顯微鏡技術(shù)對(duì)大鼠急性癲癇發(fā)作后4 h和24 h兩個(gè)時(shí)間段海馬的形態(tài)學(xué)研究表明：急性癲癇發(fā)作后4 h大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，光鏡下見錐體細(xì)胞輪廓模糊、界限不清，細(xì)胞間距加大，細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，出現(xiàn)受損的異常神經(jīng)元，海馬結(jié)構(gòu)失去完整，并見散在的深染、核固縮神經(jīng)元；電鏡下見核膜不清晰，部分神經(jīng)元表現(xiàn)為核固縮，染色質(zhì)，線粒體膜不完整，斷裂。24 h后光鏡下見錐體細(xì)胞變性、丟失加重，特別是門區(qū)、CA1和CA3區(qū)出現(xiàn)大量深染、固縮神經(jīng)元，錐體細(xì)胞稀疏；電鏡下見核膜不清晰，核固縮，染色質(zhì)邊集，線粒體膜斷裂，基質(zhì)消失，出現(xiàn)明顯空泡化，伴內(nèi)外膜的崩解，出現(xiàn)巨大線粒體，并有髓樣小體形成，部分膠質(zhì)細(xì)胞空化、腫脹，細(xì)胞器稀疏，結(jié)構(gòu)破壞，高爾基復(fù)合體囊泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。本研究顯示大鼠海馬結(jié)構(gòu)在癲癇發(fā)作4 h即出現(xiàn)神經(jīng)元變性脫失現(xiàn)象，隨時(shí)間推移神經(jīng)元脫失明顯加重，此結(jié)果與他人研究相符［4，9］。針刺具有保護(hù)癲癇繼發(fā)腦損傷作用，實(shí)驗(yàn)顯示針刺4 h，HE染色結(jié)果顯示針刺組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元較稠密，排列整齊，細(xì)胞僅有輕度水腫，細(xì)胞間距變化不明顯，受損的異常神經(jīng)元均較少；針刺治療24 h后大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元排列仍較整齊，水腫、固縮不明顯，僅散在少量的變性壞死神經(jīng)元。電鏡觀察也顯示：針刺組大鼠海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕，核膜完整光滑，核仁居中，線粒體結(jié)構(gòu)正常，嵴完整，僅見部分線粒體輕微腫脹，部分高爾基體腫脹，形成囊泡。以上結(jié)果從神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)驗(yàn)證針刺具有保護(hù)癲癇繼發(fā)腦神經(jīng)元損傷作用。但由于癲癇繼發(fā)腦損傷的多通路性和針刺作用的多靶點(diǎn)性，針刺保護(hù)癲癇繼發(fā)神經(jīng)元損傷的具體途徑尚不清楚，要想完全揭示針刺保護(hù)癲癇繼發(fā)腦損傷的機(jī)理尚需從多途徑、多靶點(diǎn)研究。

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