深低溫冷凍骨修復(fù)兔脛骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

郭 華，李龍騰

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450052)

各種原因造成的骨缺損的修復(fù)與重建是臨床骨科的一大難題，目前主要有自體骨移植、人工假體置換、同種異體骨移植以及同種異體骨移植復(fù)合人工假體置換等手術(shù)方法。選用同種異體骨作為移植物，其臨床療效已得到充分的證實(shí)［1－2］，并且同種異體骨移植是外科最早的組織和器官移植手術(shù)之一，在臨床上仍然有很大的發(fā)展空間。新鮮同種異體骨由于具有抗原性引發(fā)宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致骨移植延遲愈合或不愈合，而深低溫冷凍骨破壞了細(xì)胞表面的抗原結(jié)構(gòu)，雖不能完全消滅其抗原性，卻可以大大降低其抗原性，使移植后的排斥反應(yīng)顯著降低［3］。本實(shí)驗(yàn)通過限定深低溫冷凍不同的保存時(shí)間，進(jìn)一步探討深低溫冷凍骨修復(fù)骨缺損的效果。

1 材料和方法

1．1 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)2個(gè)月齡雄性新西蘭大白兔64只，體重(2．2±0．3)kg，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其中32只作為制備同種異體骨的供體，其余32只為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受體，隨機(jī)分為2組:A組16只，植入深低溫冷凍3個(gè)月骨;B組16只，植入深低溫冷凍6個(gè)月骨。

1．2 深低溫冷凍骨的制備

取新西蘭大白兔32只處死，無菌條件下分離右側(cè)脛骨，用線鋸從脛骨中上1/3段起截取脛骨約8mm，剔除軟組織后，脛骨用無菌鹽水進(jìn)行加壓沖洗去除骨髓組織，用甘油浸泡骨組織約30min，然后將骨放入充滿15%DMSO(二甲基亞砜)的深低溫冷凍瓶，采用逐漸降溫法，先放入－4℃的冰箱中，12h后再逐漸降至－80℃，分別于深低溫冰箱－80℃保存6個(gè)月、3個(gè)月，即為深低溫冷凍6個(gè)月骨和3個(gè)月骨。

1．3 動(dòng)物骨缺損模型的制備與骨移植

3%戊巴比妥鈉按1mg/kg行耳緣靜脈注射麻醉后，將32只新西蘭大白兔取仰臥位，沿右側(cè)脛骨內(nèi)側(cè)作一約3cm縱形切口，分離脛骨，剝離骨膜。在脛骨中上段用線鋸鋸斷脛骨，制成8mm的脛骨節(jié)段性骨缺損模型。將相同長(zhǎng)度異體骨段在37℃恒溫水浴箱快速?gòu)?fù)溫，并用慶大霉素生理鹽水反復(fù)沖洗后移植嵌入骨缺損區(qū)，修整斷端，使骨塊對(duì)位更理想，并用1．0mm克氏針將異體骨與宿主骨殘端的脛骨斷端作髓腔內(nèi)固定。所有兔脛骨缺損模型均由同一組人員完成，骨缺損長(zhǎng)度、截骨位置及內(nèi)固定方法均相同。生理鹽水沖洗創(chuàng)腔，切口內(nèi)撒入青霉素鈉800kU，縫合各層，無菌輔料包扎。麻醉清醒后，自由活動(dòng)，分籠、常規(guī)飼養(yǎng)。

1．4 術(shù)后處理

術(shù)后每只兔肌注青霉素鈉400kU，1次/天，共7天。

1．5 觀察內(nèi)容

1．5．1 各組動(dòng)物一般情況

觀察術(shù)后動(dòng)物精神狀況、進(jìn)食、大小便、肢體活動(dòng)、肢體腫脹、傷口愈合等情況。

1．5．2 骨缺損修復(fù)標(biāo)本大體觀察

在2，4，8和12周各時(shí)間點(diǎn)A、B組動(dòng)物分別取4只兔的骨缺損修復(fù)標(biāo)本，觀察骨缺損處修復(fù)情況以及骨痂生長(zhǎng)情況。

1．5．3 組織病理學(xué)觀察

取移植區(qū)標(biāo)本甲醛固定后，甲酸常規(guī)脫鈣石蠟包埋切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，Olympus光學(xué)顯微鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1．5．4 檢測(cè)骨標(biāo)本的骨密度值

在2，4，8和12周各時(shí)間點(diǎn)行標(biāo)本的骨密度測(cè)試。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)A、B組動(dòng)物取4只，去除克氏針后剔除軟組織，采用美國(guó)Norland雙能X射線骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)量骨缺損區(qū)的骨密度，每個(gè)標(biāo)本所選定的測(cè)量區(qū)的位置、面積均相同。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以×—±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2．1 一般情況

術(shù)后3h內(nèi)所有動(dòng)物均蘇醒，術(shù)后1天能站立，傷口周圍組織腫脹，淤血，進(jìn)食正常。術(shù)后2周能自由活動(dòng)，傷口無紅腫、滲液等炎性反應(yīng)，傷口Ⅰ期愈合。動(dòng)物死亡或移植骨脫出，則補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。

2．2 骨缺損修復(fù)標(biāo)本大體觀察

A組。第2周:移植骨、自身骨周圍有明顯纖維結(jié)締組織包裹，移植骨與自身骨間未出現(xiàn)骨痂，未粘連，界限清晰;第4周:移植骨與自身骨接觸端有少量骨痂，界限較模糊;第8周:移植骨與自身骨接觸端大部分骨痂明顯增多，交界處近連續(xù)，分離困難;第12周:移植骨與自體骨界線基本消失，周圍骨痂塑型良好，初步骨性愈合。

B組。第2周:移植骨、宿主骨周圍有纖維結(jié)締組織覆蓋，但移植骨與自身骨間呈游離狀態(tài)，未粘連，界限清晰;第4周:移植骨與自身骨接觸端見少許骨痂生長(zhǎng);第8周:移植骨與自身骨接觸端骨痂較前增多，界限模糊;第12周:骨痂明顯增多，分離困難，移植骨與自身骨仍未完全愈合，骨缺損區(qū)塑形差。

2．3 組織病理學(xué)觀察

A組:12周時(shí)，移植骨與自體骨連接處可見大量成熟骨小梁排列有序致密，連接處的間隙消失，形成新的板層骨結(jié)構(gòu)，大部分皮質(zhì)骨仍保留原有形態(tài)，其中可見擴(kuò)大的哈佛管和周圍軟骨的成骨活動(dòng)(圖1)。B組:12周時(shí)，移植骨與宿主骨連接處出現(xiàn)稀疏新的骨小梁，排列較紊亂，網(wǎng)眼較大，可見纖維成骨和軟骨成骨方式，新形成的哈佛系統(tǒng)較少(圖2)。

圖1 術(shù)后12周A組組織學(xué)表現(xiàn)HE×400

圖2 術(shù)后12周B組組織學(xué)表現(xiàn)HE×400

2．4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)缺損區(qū)骨密度值

結(jié)果顯示:骨密度值A(chǔ)組第8周達(dá)高峰，第12周降低;B組在2、4、8、12周骨密度值隨時(shí)間的增加而升高。A組與B組比較，在2、4周沒有顯著性差異(P＞0．05)，第8周開始有顯著差異(P＜0．05)(表1)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)2組骨標(biāo)本的骨密度值

3 討論

同種異體骨移植在骨與關(guān)節(jié)腫瘤的保肢治療及創(chuàng)傷后骨缺損的修復(fù)重建中起著重要的作用。同種異體骨移植的愈合過程受同種異體骨的制備、保存過程、手術(shù)操作等很多因素的影響。本實(shí)驗(yàn)選用新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，取骨和保存方法及手術(shù)方法與臨床應(yīng)用的方法相同，采用大體標(biāo)本觀察、組織病理學(xué)觀察、骨密度值的測(cè)量等方法完善異體骨移植后愈合過程的觀察。大體觀察、病理切片結(jié)果說明深低溫冷凍同種異體骨具有較好的修復(fù)骨缺損的能力，但保存時(shí)間過長(zhǎng)則不利于愈合。原因可能是骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic proteins－2，BMP －2)在深低溫冷凍3、6個(gè)月骨中表達(dá)逐漸下降［4］，6個(gè)月骨的BMP－2比3個(gè)月骨的BMP－2含量少，且有實(shí)驗(yàn)證明BMP－2在骨折愈合和修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用［5］，進(jìn)而骨愈合的進(jìn)程也比3個(gè)月骨慢。

此外，骨密度是一個(gè)重要的判斷骨強(qiáng)度的指標(biāo)，是峰值骨量和骨量丟失量二者的綜合，能間接反應(yīng)骨移植愈合的效果。實(shí)驗(yàn)中A組和B組深低溫冷凍骨標(biāo)本的骨密度值顯示:8周時(shí)A組的骨密度值大于B組，有顯著差異(P＜0．05)，且A組第8周骨密度值達(dá)高峰，說明此時(shí)的成骨活動(dòng)最為旺盛。第12周骨密度值又下降，則提示有骨組織被吸收分解，開始塑性改造。符合大體觀察和組織病理學(xué)觀察到的植入后12周3個(gè)月深低溫冷凍骨基本達(dá)到骨愈合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王維彬等［6］的第4～8周骨密度值為高峰結(jié)果基本一致。

綜上所述，深低溫冷凍同種異體骨具有較好的修復(fù)骨缺損的能力，是一種較為理想的骨缺損修復(fù)材料，但保存時(shí)間過長(zhǎng)則不利于骨的愈合。

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［3］陳敏，宋建榕，林佳俊，等．深低溫冷凍技術(shù)對(duì)帶血管同種異體骨移植作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40(4):378 －380．

［4］夏武憲，郭華，李龍騰，等．深低溫冷凍骨的形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)［J］．中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(37):6863－6865．

［5］Ahn J，de Gorter DJJ，Prasarn M，et al．Modulation of bone morphogenetic protein antagonists to stimulate clinicaloste ogenesis［J］．Biosci Hypotheses，2009，2(5):322 －325．

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