HPLC法同時測定七葉靈顆粒中特女貞苷與柚皮苷的含量Δ

顧嘉欽，朱珺（上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院藥劑科，上海200030）

HPLC法同時測定七葉靈顆粒中特女貞苷與柚皮苷的含量Δ

顧嘉欽＊，朱珺#（上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院藥劑科，上海200030）

目的：建立同時測定七葉靈顆粒中特女貞苷與柚皮苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V），檢測波長為224nm，流速為1mL·min－1，柱溫為30℃。結(jié)果：特女貞苷與柚皮苷的進樣量分別在0.04～1.00、0.08～2.00μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r均為0.9999）；平均加樣回收率分別為101.17%和100.32%，RSD分別為2.10%和2.17%（n均為6）。結(jié)論：本方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于七葉靈顆粒中特女貞苷與柚皮苷的含量測定。

高效液相色譜法；七葉靈顆粒；特女貞苷；柚皮苷；含量測定

肺癌是近50年增長最快的惡性腫瘤之一，居我國癌癥發(fā)病率、死亡率之首[1]。七葉靈顆粒是我院自行研制的復(fù)方中藥制劑，由生黃芪、黃精、女貞子、天花粉、靈芝、石見穿、七葉一枝花、山慈菇、骨碎補、陳皮10味藥材組成。該藥是我院根據(jù)中醫(yī)扶正祛邪、調(diào)節(jié)陰陽平衡理論，總結(jié)30多年臨床腫瘤治療經(jīng)驗，在中醫(yī)辯證論治基礎(chǔ)上自行研制的抗腫瘤藥物，也是目前為數(shù)不多的治療肺癌的特色醫(yī)院制劑。經(jīng)多年來的實驗研究和臨床應(yīng)用證實，七葉靈顆粒不僅有抑瘤作用，同時還能減輕化療副作用，增加腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)，升高白細(xì)胞，提高晚期肺癌患者的生存率、近期療效及生存質(zhì)量，并延長其中位生存期[2～4]。中藥制劑現(xiàn)代化的關(guān)鍵在于質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化[5]，因此筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定七葉靈顆粒中有效成分特女貞苷與柚皮苷的含量，為七葉靈顆粒提供一種質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

LC-10Ai系列HPLC儀，配有SPD-20A紫外檢測器、SIL-10Ai自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器（日本島津公司）。

特女貞苷（純度：92.1%）、柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111926-201102、110722-200610）；七葉靈顆粒（上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院研制，上海市蔡同德堂中藥制藥廠代加工，批號：20100901、20110101、20110701、20111101）；甲醇、乙腈均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V）；檢測波長：224nm；流速：1mL·min－1；柱溫：30℃；進樣量：20μL。理論板數(shù)按特女貞苷峰計算應(yīng)不小于4000。在該色譜條件下，特女貞苷峰與柚皮苷峰分離良好，且與其他雜質(zhì)峰也分離良好。

2.2 對照品溶液的制備

取特女貞苷對照品14.1mg（含量測定以92.1%計），精密稱定，置于50mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.2597mg·mL－1的特女貞苷對照品溶液。于2～8℃低溫保存，備用。

取柚皮苷對照品8.1mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.81mg·mL－1的柚皮苷對照品溶液。于2～8℃低溫保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取七葉靈顆粒10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，稱重，加熱回流1h，放冷，再稱重，用50%乙醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方配比取各味藥（缺女貞子、骨碎補、陳皮），根據(jù)七葉靈顆粒制備工藝制成陰性樣品，再按“2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取“2.2”項下2種對照品溶液，分別用甲醇稀釋制成濃度為20μg·mL－1的特女貞苷對照品溶液和40μg·mL－1的柚皮苷對照品溶液，分別吸取2、5、10、20、30、50μL進樣，測定峰面積。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得特女貞苷、柚皮苷的回歸方程分別 為 Y＝2.65×104X+842（r＝0.9999，n＝6）、Y＝7.16×104X+8497（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，特女貞苷、柚皮苷的進樣量分別在0.04～1.00、0.08～2.00μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取濃度為20μg·mL－1的特女貞苷對照品溶液和40μg·mL－1的柚皮苷對照品溶液各20μL，在上述色譜條件下連續(xù)進樣5次，測定峰面積。結(jié)果，特女貞苷和柚皮苷峰面積的RSD分別為2.28%和1.97%（n均為5），表明儀器精密度良好。

2.5.3 特女貞苷峰與柚皮苷峰的鑒別試驗 經(jīng)多次調(diào)整流動相種類和配比，在流動相為乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V）時，七葉靈顆粒樣品中特女貞苷峰與柚皮苷峰分離良好，通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）檢測可證明該峰為特女貞苷峰與柚皮苷峰，詳見圖1、圖2。

2.5.4 空白干擾試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20μL，在上述色譜條件下進樣測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特女貞苷峰與柚皮苷峰處陰性對照無干擾。色譜見圖3。

圖1 特女貞苷的MS圖A.ESI（+）模式下的特女貞苷對照品（m/z 686.6，35.1min峰）；B.ESI（－）模式下的特女貞苷對照品（m/z 686.6，35.1min峰）；C.ESI（+）模式下的供試品（35.2min峰）；D.ES（I－）模式下的供試品（35.2min峰）Fig 1MS chromatograms of specnuezhenideA.specnuezhenide control under ESI（+）mode（m/z 686.6，35.1min）；B.specnuezhenide control under ESI（－）mode（m/z 686.6，35.1min）；C.test sample under ESI（+）mode（35.2min）；D.test sample under ESI（－）mode（35.2min）

圖2 柚皮苷的MS圖A.ESI（+）模式下的柚皮苷對照品；B.ESI（－）模式下的柚皮苷對照品；C.ESI（+）模式下的供試品（40.53min峰）；D.ESI（－）模式下的供試品（40.53min峰）Fig 2MS chromatograms of naringinA.naringin control under ESI（+）mode；B.naringin control under ESI（－）mode；C.test sample under ESI（+）mode（40.53min）；D.test sample under ESI（－）mode（40.53min）

圖3 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.陰性對照；C.供試品；1.特女貞苷；2.柚皮苷Fig 3 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.negative control；C.test sample；1.specnuezhenide；2.naringin

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液20μL，分別于0、1、2、3、4、5d時進樣，測定峰面積。結(jié)果，特女貞苷和柚皮苷峰面積的RSD分別為3.01%和2.14%（n均為6），表明供試品溶液在5d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗 取同一批七葉靈顆粒，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣20μL，測定樣品含量。結(jié)果，樣品中特女貞苷的含量為（85.36±3.73）μg·g－1，RSD＝4.37%（n＝6）；柚皮苷的含量為（159.67±27.42）μg·g－1，RSD＝1.72%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批（批號：20111101）樣品6份，每份5g，精密稱定，分別加入特女貞苷對照品約0.5mg和柚皮苷對照品約1mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，各取20μL進樣，在上述色譜條件下測定峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果分別見表1和表2。

表1 特女貞苷的加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery test of specnuezhenide（n＝6）

表2 柚皮苷的加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery test of naringin（n＝6）

2.6 樣品含量測定

取4批樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述方法操作，取20μL進樣測定，計算樣品中特女貞苷和柚皮苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝4）Tab 3Results of content determination of samples（n＝4）

從4批樣品含量測定結(jié)果來看，七葉靈顆粒含特女貞苷與柚皮苷量穩(wěn)定，可應(yīng)用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

女貞子是一味常用的扶正固本藥，具有抗炎抑菌、升高白細(xì)胞、促進免疫等作用[6]，《中國藥典》[7]中其主要檢測成分為特女貞苷，且專屬性強。骨碎補也是一味常用中藥，現(xiàn)代藥理及臨床研究表明，骨碎補具有良好的促進骨折愈合、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、促進牙齒生長、防治中毒性耳聾、降血脂等活性[8]，《中國藥典》[7]中其主要檢測成分為柚皮苷；文獻報道陳皮中也含有柚皮苷[9]，因此在空白試驗中去除了這3味藥材。

由于七葉靈顆粒由10味藥材組成，成分復(fù)雜，為能同時檢測特女貞苷與柚皮苷，筆者參考了《中國藥典》[7]及文獻[10]方法，以甲醇-水作為展開劑，特女貞苷出峰好，但柚皮苷出峰不尖銳；通過不斷探索和調(diào)整，使用乙腈-4%冰醋酸（17∶83，V/V）為展開劑，可避開前后雜質(zhì)干擾，且特女貞苷與柚皮苷出峰尖銳、分離度好、理論板數(shù)高。由于前后均有雜質(zhì)峰，因此梯度洗脫受到限制，故未采用梯度洗脫方法，而是通過空白對照試驗和借助LC-MS鑒別出特女貞苷峰與柚皮苷峰。

七葉靈顆粒制作工藝采用的是水提法，因此為避免損失，在參考《中國藥典》[7]及文獻[10]方法的基礎(chǔ)上，本試驗對比了超聲法與回流法的提取效果，結(jié)果相同時間內(nèi)特女貞苷的提取回收率回流法大于超聲法，因此采用回流法提取。試驗還對乙醇和甲醇進行了回流對比試驗，發(fā)現(xiàn)乙醇回流較甲醇回流的特女貞苷提取回收率更高，柚皮苷則差異不大，因此選擇乙醇回流法。通過不同濃度乙醇回流試驗，發(fā)現(xiàn)低濃度乙醇（30%）較高濃度乙醇（70%）回流的特女貞苷提取回收率高，而柚皮苷基本相同，但低濃度乙醇回流雜質(zhì)多，且不宜濾過，故最終確定采用50%乙醇進行回流試驗。本試驗還比較了不同時間回流對結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)回流1、2、4h的結(jié)果差異不大，這可能與顆粒劑原本就是水提物質(zhì)與糊精，回流1h足以將特女貞苷與柚皮苷溶于溶媒內(nèi)有關(guān)，因此選擇使用50%乙醇回流1h的提取方法，該方法操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定。

[1] 羅榮城，韓煥興.腫瘤綜合治療新進展[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：295.

[2] 崔 清，金長娟.“七葉靈”顆粒抑制H460細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移作用靶點的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2009，76（8）：157.

[3] 金長娟，沙慧芳，趙蘭香，等.七葉靈方誘導(dǎo)裸鼠人肺腺癌A549移植瘤細(xì)胞凋亡的實驗研究[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2004，2（4）：285.

[4] 崔 清，王少墨，郭毅峻，等.“七葉靈”顆粒配合化療治療晚期肺癌臨床研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2007，41（3）：14.

[5] 文世偉，黃躍洲，許 靜.試論中藥制劑現(xiàn)代化的關(guān)鍵問題及策略[J].中國藥房，2008，19（27）：2157.

[6] 秦紅霖，高 月.女貞子化學(xué)成分及藥理研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18（1）：84.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：43、239.

[8] 劉玲玲，曲 瑋，梁敬鈺.骨碎補化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J].海峽藥學(xué)，2012，24（1）：4.

[9] 李慶耀，梁生林.陳皮的藥用研究進展[J].中成藥，2008，30（2）：246.

[10] 王衛(wèi)清，黃 海，洪松彬.高效液相色譜法測定女貞子中特女貞苷含量的實驗研究[J].健康必讀，2011，7：356.

Content Determination of Specnuezhenide and Naringin in Qiyelin Granules by HPLC

GU Jia-qin，ZHU Jun（Dept.of Pharmacy，Shanghai Chest Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200030，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of specnuezhenide and naringin in Qiyelin granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of acetonitrile-4%acetic acid（17∶83，V/V）at flow rate of 1mL·min－1.The detection wavelength was 224nm，and the column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range was 0.04～1.00μg for specnuezhenide（r＝0.9999）and 0.08～2.00μg for naringin（r＝0.9999）with average recovery of 101.17%（RSD＝2.10%，n＝7）and 100.32%（RSD＝2.17%，n＝6），respectively.CONCLUSION：The method is simple，accurate and reproducible.It can be used for the content determination of specnuezhenide and naringin in Qiyelin granules.

HPLC；Qiyelin granules；Specnuezhenide；Naringin；Content determination

R283.625；R927.2

A

1001-0408（2012）43-4086-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.43.21

2012-07-17

2012-09-10）