蕎麥抗感染多肽研究進(jìn)展

李宗杰 周一鳴 周小理

蕎麥抗感染多肽研究進(jìn)展

李宗杰 周一鳴 周小理

(上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418)

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在蕎麥種子內(nèi)發(fā)現(xiàn)了很多抗菌肽、抗腫瘤多肽以及胰蛋白酶抑制劑等抗感染多肽，這些多肽的結(jié)構(gòu)特征和實(shí)際應(yīng)用的研究越來(lái)越受關(guān)注。主要綜述了蕎麥抗感染多肽的分子結(jié)構(gòu)特征，抗菌、抗腫瘤、胰酶抑制等生理活性及其作用信號(hào)機(jī)制等方面的研究進(jìn)展。

蕎麥 蕎麥抗感染多肽 抗菌肽 抗腫瘤多肽 胰蛋白酶抑制劑

抗感染多肽是構(gòu)成宿主生物初級(jí)免疫系統(tǒng)的重要分子基礎(chǔ)，是宿主生物防御微生物感染的天然屏障，主要包括蕎麥抗菌肽［1－2］、蕎麥抗腫瘤多肽［3］以及蕎麥胰蛋白酶抑制劑［4］。蕎麥作為一種重要的糧食作物，研究其體內(nèi)的抗菌肽等化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道較少，因此，蕎麥抗感染多肽的生理活性、作用機(jī)理、分子結(jié)構(gòu)及編碼基因序列等領(lǐng)域非常值得深入研究和探討。

事實(shí)上，相當(dāng)一部分蕎麥抗感染多肽往往不只具有一種生物活性，如蕎麥抗真菌多肽兼有抗腫瘤活性和抗病毒活性［2］，而蕎麥胰蛋白酶抑制劑兼有抗菌活性［4］或者抗腫瘤活性［5－8］。蕎麥多肽在降血糖、降血壓的同時(shí)，還具有清除自由基等抗氧化活性。因此，蕎麥抗感染多肽是多功能活性肽，在抵抗微生物感染、提高機(jī)體免疫力等研究領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。

本文主要綜述了近幾年蕎麥中被發(fā)現(xiàn)的多種抗感染多肽的結(jié)構(gòu)特征及其抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤等生理活性，分析了國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展，為研究蕎麥多肽的分子結(jié)構(gòu)、編碼基因、生理功能以及實(shí)際應(yīng)用提供了思路，為設(shè)計(jì)、加工、制備蕎麥活性肽提供基礎(chǔ)信息，同時(shí)也為研究蕎麥抗感染多肽在功能性食品中的應(yīng)用提供理論支持。

1 蕎麥抗菌肽的結(jié)構(gòu)及功能

Fujimura等［1］在甜蕎中分離得到的兩個(gè)蕎麥抗菌肽Fa－AMP1和Fa－AMP2相對(duì)分子質(zhì)量分別是3 880 Da和3 907 Da，兩者一級(jí)結(jié)構(gòu)十分相似，僅僅在C末端有一個(gè)氨基酸不同，同源性高達(dá)97．5%。后來(lái)，Leung等［2］分離的蕎麥抗真菌多肽的相對(duì)分子質(zhì)量為3 911 Da，遺憾的是測(cè)序后僅僅得到N端15個(gè)氨基酸序列。但是這部分氨基酸序列與Fa－AMP1、Fa－AMP12的N端序列完全一致，因此該抗真菌多肽的分子結(jié)構(gòu)有待于繼續(xù)闡明。

目前，已經(jīng)在蕎麥［1－2］、小麥［9］、蘿卜［10］等十幾種植物中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)［11］，植物抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)存在著相當(dāng)保守的序列(見(jiàn)表1)，即分子內(nèi)都含有8個(gè)半胱氨酸(Cys)，組成4對(duì)分子內(nèi)二硫橋。二硫橋是體外合成多肽技術(shù)面臨的重要難題，合成1～2對(duì)分子內(nèi)二硫橋的準(zhǔn)確配對(duì)率已經(jīng)有較高的技術(shù)要求，合成4對(duì)分子內(nèi)二硫橋的技術(shù)難度較大，本實(shí)驗(yàn)室與合作單位就合成蕎麥抗菌肽進(jìn)行了多次嘗試，經(jīng)質(zhì)譜、測(cè)序鑒定尚未得到純度較高、二硫鍵配對(duì)準(zhǔn)確的目標(biāo)多肽。然而，體外分離天然蕎麥抗菌肽或抗菌蛋白也頗費(fèi)時(shí)費(fèi)力，設(shè)計(jì)引物克隆蕎麥抗感染多肽的編碼基因，轉(zhuǎn)染原核生物進(jìn)行體外表達(dá)將會(huì)是短時(shí)間得到大量多肽產(chǎn)物的好方法。

由于植物抗菌肽氨基酸序列與人體防御素、昆蟲(chóng)防御素相似，二級(jí)結(jié)構(gòu)上形成3段反平行的β折疊和一個(gè)與之相伴隨的α螺旋，因此三維結(jié)構(gòu)的折疊方式也基本相似，所以統(tǒng)稱為植物防御素(Plant defensins)［11－12］。結(jié)構(gòu)的相似性決定了其生理功能也大致相同，抗菌肽的作用機(jī)制是通過(guò)將α螺旋插入微生物細(xì)胞膜形成離子通道而殺死病原菌。研究表明，培養(yǎng)液中不同離子強(qiáng)度對(duì)抗菌肽抑菌活性影響不同，一般來(lái)說(shuō)二價(jià)離子比一價(jià)離子作用強(qiáng)，而二價(jià)離子中Ca2+比Mg2+作用強(qiáng)。但是，植物防御素對(duì)人體和植物細(xì)胞本身沒(méi)有明顯的毒性對(duì)真菌等微生物卻有很強(qiáng)的殺傷力和廣譜抗菌性。

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抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)Fa－AMP1和Fa－AMP2具有抗菌光譜性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌——密西根棒形桿菌(Clavibacter michiganesis)和萎蔫短小桿菌(Curtobacterium flaccumfaciens)、革蘭氏陰性菌——軟腐病菌(Erwinia cartovora)、放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)和毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)以及真菌——尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和白地霉菌(Gotrichum candidum)都有明顯地抑菌作用。而另一個(gè)蕎麥抗真菌多肽除了抑制尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)增殖外，還可以抑制花生褐斑病菌(Mycosphaerella arachidicola)的生長(zhǎng)。更有意義的是，該抗真菌多肽還可抑制肝癌細(xì)胞HepG2、肺癌細(xì)胞WRL68、乳腺癌細(xì)胞MCF－7以及白血病細(xì)胞L1210四種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，甚至還可抑制艾滋病病毒HIV－1的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。

2 蕎麥蛋白提取物和蕎麥抗腫瘤多肽的研究概況

蕎麥蛋白提取物(Buckwheat protein extract，BWPE)是包含多種化學(xué)組分的混合物，包括蛋白質(zhì)、脂肪、非纖維素碳水化合物等［13－14］。動(dòng)物試驗(yàn)表明，食用蕎麥蛋白提取物可以通過(guò)降低雌二醇緩解乳腺癌的癥狀［15］;給大鼠飼喂蕎麥蛋白提取物可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，從而使結(jié)腸癌的患病幾率降低47%［16］。

Guo等［3］將蕎麥水溶蛋白進(jìn)行分離純化，得到了一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為57 000 Da的多肽，并命名為T(mén)BWSP31。抗腫瘤活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TBWSP31對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株Bcap37細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且存在時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TBWSP31通過(guò)引起B(yǎng)cap37 G0/G1細(xì)胞周期阻滯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其信號(hào)分子機(jī)制是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞凋亡基因Fas和下調(diào)細(xì)胞凋亡抑制基因bcl－2實(shí)現(xiàn)的［17］。目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在蕎麥中分離純化得到一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為38 000 Da的活性蛋白(數(shù)據(jù)未列出)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

3 蕎麥胰蛋白酶抑制劑的研究現(xiàn)狀

自從1983年Ikeda首次從蕎麥種子中分離得到胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor，TI)以來(lái)［18］，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后發(fā)現(xiàn)了很多蕎麥胰蛋白酶抑制劑(Buckwheat trypsin inhibitor，BWI)亞型［19－23］，對(duì)其理化性質(zhì)、氨基酸序列、編碼基因、三維結(jié)構(gòu)等方面的研究不斷深入。目前，蕎麥胰蛋白酶抑制在抗菌、抗腫瘤、抗艾滋病病毒、醫(yī)藥方面應(yīng)用以及抗病蟲(chóng)害等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注。

據(jù) Dunaevsky等［4］報(bào)道，BWI－1可以抑制鏈格孢菌(Alternaria alternataand)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等真菌的孢子和菌絲體生長(zhǎng)。1995年，Belozersky等［19］克隆得到編碼蕎麥胰蛋白酶抑制劑BWI－1a的基因，并將其命名為ISP，很遺憾的是并沒(méi)有在GenBank登錄。14年后，俄羅斯科學(xué)家將BWI－1的編碼基因ISP轉(zhuǎn)染西紅柿植株后，發(fā)現(xiàn)可以抑制番茄病原細(xì)菌Pseudomonas syringae pv．tomato和 Clavibacter michiganensis sbsp．michiganensis有明顯的抑菌活性［24］。此外，據(jù)報(bào)道重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑編碼基因(GenBank登錄號(hào):AY335158和DQ289792)的體外原核表達(dá)的產(chǎn)物rBTI對(duì)人白血病細(xì)胞 HL－60，K562，IM－9細(xì)胞系、人食管鱗癌EC9706細(xì)胞系，肝癌HepG2細(xì)胞系和人宮頸癌 He-La細(xì)胞系都有一定的生長(zhǎng)抑制活性［5－8］。通過(guò)研究重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑(Recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI)晶體的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合牛胰蛋白酶后 rBTI分子的 P8'位點(diǎn)的氨基酸殘基Trp53構(gòu)象變化，因此，野生型rBTI及其突變體做為研究設(shè)計(jì)新型抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物具有很好的研究前景［25］。

4 研究展望

蕎麥抗菌肽、抗腫瘤多肽以及胰蛋白酶抑制劑等抗感染多肽的理論研究和實(shí)際應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展，但是蕎麥抗感染多肽的編碼基因、高級(jí)結(jié)構(gòu)以及作用的信號(hào)機(jī)制等領(lǐng)域值得深入研究和進(jìn)一步闡明。蕎麥抗菌肽可以作為新型肽類抗生素，但在人體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道;蕎麥抗腫瘤多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外試驗(yàn)取得了很好的試驗(yàn)結(jié)果，但分離純化后的高純度樣品在癌癥病人的臨床研究尚未開(kāi)始;蕎麥胰蛋白酶抑制劑BWI作為醫(yī)藥領(lǐng)域的先導(dǎo)化合物有很好的應(yīng)用前景，但其抑制絲氨酸蛋白酶的生理活性也尚未引起足夠重視。

總之，如何將蕎麥抗感染多肽在功能性食品、食品添加劑以及藥物領(lǐng)域廣泛應(yīng)用已迫在眉睫，尚需加大投入深入研究。

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Advance of Studies on Buckwheat Anti－infection Peptide

Li Zongjie Zhou Yiming Zhou Xiaoli
(Shanghai Institute of Tech－nology，Shanghai 201418)

Recently，large amount of anti－infection peptides were identified from buckwheat seeds bu foreign and domestic scholars，such as anti－microbial peptide，anti－tumor peptide，trypsin inhibitor and so on．The structural characterization and practical application of these peptides attracted more and more interest of investigators all over the world．In this paper，the advances in structural characterization，biological activities like anti－ microbial，anti－tumor and trypsin inhibitory activities，and the signal mecha-nism of buckwheat anti－ infection peptides were reviewed．

buckwheat，anti－infection peptide，anti－microbial peptide，anti－tumor peptide，trypsin inhibitor

TS219

A

1003－0174(2012)01－0120－04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31071527)

2011－04－25

李宗杰，男，1982年出生，講師，生物活性肽結(jié)構(gòu)功能

周小理，女，1957年出生，教授，食品新資源及其功能