天然燕麥肽的提取工藝優(yōu)化及生物活性初探

徐建國 郝艷芳 介琳霞 田呈瑞 閆華娟

天然燕麥肽的提取工藝優(yōu)化及生物活性初探

徐建國1，2郝艷芳1介琳霞1田呈瑞2閆華娟1

(山西師范大學食品科學與工程系1，臨汾 041004)
(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院2，西安 710062)

以山西產裸燕麥為原料，采用單因素和二次回歸旋轉組合試驗研究了不同因素對燕麥肽得率的影響，確定了天然燕麥肽提取的最佳工藝參數，并探討了燕麥肽的生物活性。試驗結果表明，在試驗范圍內各因素對燕麥肽得率的影響程度由大到小依次為:提取溫度、料液比、提取時間。提取燕麥肽的最優(yōu)工藝參數為液料比16∶1(mL/g)，提取時間72 min，提取溫度34℃。在此條件下，試驗得到的燕麥肽得率為5．54 mg/g。生物活性試驗結果表明，天然燕麥肽具有一定的抗氧化和降血壓活性。

燕麥 肽 生物活性

作為一種人類和動物消費的谷物，燕麥(Avena L．)營養(yǎng)豐富，且富含酚類物質、甾醇、植酸、維生素E 等多種生物活性成分［1－3］，具有抗氧化、降血壓、降血脂和降血糖等多種生理功能［4－6］。特別是燕麥蛋白質，含量高且營養(yǎng)均衡［7］，近年來一些研究人員利用燕麥蛋白通過酶解制備生物活性肽。管驍等［8］利用胰蛋白酶水解燕麥蛋白制備并分離出一種新的強活性的血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽，確定其氨基酸序列為 Glu－Gly－Gly－Tyr－Arg;韓揚等［9］研究了超聲輔助 Alcalase酶直接水解燕麥麩皮制備燕麥ACE抑制肽的工藝條件，提高了抑制肽的含量和活性;馬海樂等［10］采用超聲波預處理燕麥蛋白后，再用堿性蛋白酶水解制備ACE抑制肽，不但提高了肽活性，而且縮短了酶解時間。以上研究均是利用外源酶水解燕麥蛋白制備生物活性肽，表明燕麥是一種良好的ACE抑制肽蛋白源。但遺憾的是，關于燕麥中天然肽的提取及其生物活性研究還未見報道。本研究主要優(yōu)化天然燕麥肽的提取工藝，探討其抗氧化性及ACE抑制活性，以期為燕麥資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗材料及試劑

燕麥:來自于山西呂梁地區(qū);1，1－苯基－2－苦肼基自由基(DPPH)、2，2－聯(lián)氮－3－乙苯－二噻唑－6磺酸(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox)、血管緊張素轉化酶(ACE)、馬尿酰－組氨酰－亮氨酸(Hip－His－Leu，HHL):Sigma公司;Fe3+－三吡啶三吖嗪(TPTZ):Fluka公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、還原型谷胱甘肽:西安舟鼎國生物技術有限責任公司。

1．2 主要儀器與設備

XW－80A旋渦混合儀:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;5840R冷凍離心機:Gene公司;TU－1900紫外分光光度計:北京普析通用有限公司。

1．3 試驗方法

1．3．1 肽的提取

稱取燕麥籽粒，粉碎后放入錐形瓶中，正己烷脫脂處理。干燥后加入一定量的0．1 mol/L Tris－HCl緩沖液(pH 8．8)提取一定的時間后，在4℃，5 000 r/min離心15 min取上清液。上清液中加入等體積12%三氯乙酸，混合后靜置30 min，在4℃，10 000 r/min離心15 min沉淀大分子蛋白質，所得上清液即為燕麥肽提取液。

1．3．2 肽含量的測定

肽含量測定采用雙縮脲法，以還原型谷胱甘肽為標準品，建立的回歸方程為:y=0．124x+0．001 4(0 ～100 g/mL，R2=0．999 6)，其中 y為吸光度，x表示肽含量，單位為μg/mL。

1．3．3 燕麥肽提取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗結果的基礎上，進行二次回歸正交旋轉組合設計試驗，采用DPS統(tǒng)計分析軟件對試驗結果進行分析，優(yōu)化提取工藝。各因素水平及編碼如表1所示。

表1 試驗因素和編碼水平表

1．3．4 燕麥肽生物活性測定

1．3．4．1 DPPH 自由基清除能力的測定

測定方法參照文獻［11］稍作修改，取0．5 mL提取液和4．5 mL 60μmol/L的DPPH甲醇溶液混勻，室溫下避光靜置30 min后517 nm下測吸光度。

DPPH自由基的清除率=(1－A1/A0)×100%

式中:A0為0．5 mL甲醇+4．5 mL DPPH溶液的吸光度;A1為0．5 mL樣品溶液+4．5 mL DPPH溶液的吸光度。

為進一步說明燕麥對DPPH自由基的清除能力，以水溶性維生素E(Trolox)溶液做標準對照，以濃度為橫坐標，清除率為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為 y=0．717 3x－1．96(20 ～120 μmol/L，R2=0．999 8)，DPPH自由基的清除能力結果以每100克燕麥樣品相當于Trolox的微摩爾數表示。

1．3．4．2 鐵還原能力(FRAP)的測定

測定方法根據文獻［11］進行。

1．3．4．3 ABTS 自由基清除能力的測定

測定方法根據文獻［12］進行。

1．3．4．4 ACE 抑制活性測定

參照文獻［13］稍作修改。取5 mmol/L Hip－His－Leu(HHL)溶液 80 μL(pH 8．3，0．1 mol/L 硼砂－硼酸緩沖液含0．3 mol/L NaCl)與40μL燕麥肽混合。37℃水浴預熱5 min后，加入10μL ACE溶液(0．25 U溶于2．5 mL同樣的緩沖液)，繼續(xù)保持37℃水浴 30 min。隨后加入 1 mol/L HCl溶液200μL終止反應，再加入冷凍后的乙酸乙酯1．2 mL，旋渦混合均勻，以萃取反應體系中的馬尿酸。3 000 r/min離心10 min后取出0．9 mL酯層溶液轉入另一試管中，90℃烘箱烘干，并重新溶于3 mL去離子水中，在228 nm波長處測定吸光值。ACE抑制率計算公式為:

式中:A1為不存在ACE抑制肽時的吸光度;A2為ACE及ACE抑制肽都存在時的吸光度;A3為ACE及ACE抑制肽都不存在時的吸光度。

2 結果與分析

2．1 燕麥肽提取的單因素試驗

2．1．1 液料比對肽得率的影響

固定提取溫度為30℃，提取時間為60 min，考察液料比對肽得率的影響。結果見圖1。由圖1可知，燕麥肽得率隨著液料比的提高而逐漸增加，當液料比高于15∶1(mL/g)時，燕麥肽得率沒有明顯變化。液料比過大不但會增加溶劑用量，而且會增加后續(xù)工藝的難度。因此，提取時選擇液料比為15∶1較為合適。

圖1 液料比對肽得率的影響

2．1．2 提取時間對肽得率的影響

固定提取溫度為30℃，液料比為15∶1，考察提取時間對肽得率的影響。提取時間對燕麥肽得率的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著提取時間的延長，肽的得率明顯增加，提取60 min時，基本達到最大值，此后再延長提取時間，肽得率并沒有明顯增加?？赡苁怯捎诮釙r間的延長，肽越來越多溶解到溶液里所致，當體系達到內外滲透平衡時，肽得率基本趨于穩(wěn)定。因此確定最佳提取時間為60 min。

圖2 提取時間對肽得率的影響

2．1．3 提取溫度對肽得率的影響

固定提取液料比為15∶1，提取時間為60 min，考察提取溫度對肽得率的影響。提取溫度對燕麥肽得率的影響結果見圖3。由圖3可知，提取溫度在4～30℃范圍內，隨著提取溫度的升高，肽得率明顯增加，溫度為30℃時，基本達到最大值。主要是由于隨著溫度的升高，分子運動加劇，肽在浸提液中的溶解度增大。當溫度在30～40℃肽得率沒有明顯變化，此后，隨著溫度的升高，肽得率有下降的趨勢，原因可能是較高的溫度會使燕麥淀粉糊化，阻礙肽的溶出。另外，過高的提取溫度也會造成肽的熱變性。因此確定最佳提取溫度為30℃，不宜超過40℃。

圖3 提取溫度對肽得率的影響

2．2 二次回歸旋轉組合試驗優(yōu)化燕麥肽提取工藝

2．2．1 二次回歸旋轉組合設計結果

由DPS統(tǒng)計分析軟件的試驗設計功能可知，三因子二次回歸旋轉組合設計包括23個試驗方案，具體試驗方案及試驗結果如表2所示。

表2 試驗設計及結果

2．2．2 回歸方程的建立與檢驗

根據表2結果，建立燕麥肽得率與液料比X1、提取時間X2、提取溫度X3的三因子的數學回歸模型為:Y=5．371 2+0．263 3X1+0．245 4X2+0．309 2 X3－0．330 1X12－0．195 8X22－0．171 0X32－0．131 3X1X2－0．136 3X1X3+0．058 8X2X3。由方差分析(表3)可知，回歸方程的失擬性檢驗 F1＜F0．05(5，8)，差異不顯著;顯著性檢驗 F2＞ F0．01(9，13)，差異極顯著，這說明所建立的二次回歸模型是適當的。在α=0．10顯著水平剔除不顯著項，得到優(yōu)化后的方程為:Y=5．371 2+0．263 3X1+0．245 4X2+0．309 2X3－0．330 1X1

2－0．195 8X22－0．171 0X3

2－0．136 3X1X3。

2．2．3 各因素的影響程度分析

各因素的F值可以反映出各因素對試驗指標的重要性。從方差分析結果可知，對燕麥肽得率影響程度的因素由大到小依次為提取溫度、液料比、提取時間。

表3 試驗結果方差分析表

2．2．4 雙因素交互作用分析

由表3可知，本試驗所建立的數學回歸模型中，在α=0．10水平上，只有X1和X3因素交互作用顯著，即液料比和提取溫度的交互作用對燕麥肽得率有顯著的影響。因此，固定提取時間于零水平，得到液料比和提取溫度交互作用的響應曲面圖和等高線圖如圖4所示。

由圖4可知，燕麥肽得率隨液料比和提取溫度的變化會產生較大變化。隨著二因素編碼值的升高，肽得率呈明顯上升趨勢，但當編碼值達到一定的組合后，肽得率開始下降。原因可能是過大的液料比使分離效率降低，肽損失率增加;過高的溫度會導致淀粉的糊化，影響肽的溶出，這與單因素的分析結果一致。由此可知，只有當液料比和提取溫度合理搭配時才能獲得更好的提取效果。

圖4 液料比與提取溫度對肽得率的交互作用分析

2．2．5 提取工藝參數的優(yōu)化及驗證

通過DPS軟件分析，采用頻率分析方法尋找最優(yōu)提取條件，其中肽得率高于4．96 mg/g的方案有25個，頻率分析結果見表4。由表4可知，在95%的置信區(qū)間內肽得率高于4．96 mg/g的優(yōu)化提取方案為:液料比14．886 ～16．554 mL/g，提取時間66．12 ～78．52 min，提取溫度32．48 ～35．7 ℃，取優(yōu)化后提取條件的平均值方案，X1=0．24，X2=0．616，X3=0．818，即液料比 15．72 mL/g，提取時間 72．32 min，提取溫度34．09℃。為便于指導實際生產，將最優(yōu)組合方案定為:液料比16 mL/g，提取時間72 min，提取溫度34℃。按最優(yōu)組合方案中的提取條件進行驗證試驗，重復三次，取平均值，測得燕麥肽得率Y=5．54 mg/g，與理論值(5．60 mg/g)接近，其相對誤差為1．07%，進一步驗證了數學回歸模型的適合性。

表4 大于4．96 mg/g的25個方案中各變量取值的頻率分布

2．3 天然燕麥肽的生物活性研究

天然燕麥肽的生物活性性測定結果見表5。由表5可知，燕麥中肽清除DPPH、ABTS自由基的能力分別相當于 0．21、9．96 μmol Trolox/100 g燕麥，鐵還原能力為1．08μmol Fe(Ⅱ)/g燕麥，ACE抑制率為4．42%。試驗結果說明，天然燕麥肽不但具有一定的抑制ACE活性，而且具有抗氧化性。然而天然燕麥肽的結構及作用機制等還有待深入研究。

表5 燕麥肽的抗氧化性和ACE抑制活性

3 結論

3．1 通過試驗結果的方差分析可知，在本試驗范圍內，各因素對天然燕麥肽得率的影響作用大小順序依次為:提取溫度、液料比、提取時間。

3．2 天然燕麥肽提取條件的數學回歸模型為:Y=5．371 2+0．263 3X1+0．245 4X2+0．309 2X3－0．330 1X12－0．195 8X22－0．171 0X32－0．136 3X1X3。采用此模型在本試驗范圍內能較準確地預測天然燕麥肽的得率。

3．3 通過頻率分析方法得到的最優(yōu)提取條件為:液料比16∶1(mL/g)，提取時間72 min，提取溫度34℃。在此條件下，預測燕麥肽得率為5．60 mg/g，試驗得到的燕麥肽得率為 5．54 mg/g，其相對誤差為1．07%，進一步驗證了數學回歸模型的適合性。

3．4 天然燕麥肽具有一定的抗氧化能力和降血壓活性，但對于天然燕麥肽的分離純化、組分及結構鑒定等，還有待于進一步研究。

志謝:山西省大學生創(chuàng)新性實驗項目資助。

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Primary Study on Extracting Tech－nology Optimization and Biological Activity of Peptides from Natural Oat Groats

Xu Jianguo1，2Hao Yanfang1Jie Linxia1Tian Chengrui2Yan Huajuan1
(Department of Food Science and Engineering，Shanxi Normal University2，Linfen 041004)
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University1，Xi'an 710062)

Taking the naked oat seeds as raw materials，the effects of different factors on peptide yield and optimum parameters for extraction Tech－nology of natural peptide from oat groats were determined by the single－factor experiment and quadratic orthogonal rotation regression combination design and the bioactivity of peptides was investigated．The result showed that the effect sequences of three factors for peptide yield were as follows:extraction temperature，liquid－to－solid ratio，and extraction time．The optimal extraction parameters were as follows:liquid－tosolid ratio of 16∶1(mL/g)，extraction time of 72 min，and extraction temperature of 34 ℃．Under the said conditions，the yield of peptide from oat groats was 5．54 mg/g．The biological activity test exhibited that the oats had certain antioxidant activity and effect of reducing blood pressure．

oat，peptide，bioactivity

TS201．1

A

1003－0174(2012)01－0020－05

山西省高校科技開發(fā)項目(2010112)

2011－03－24

徐建國，男，1971年出生，副教授，食品科學