花生肽對衰老模型大鼠血清和心、腦組織抗氧化效果的影響

陳貴堂 趙立艷 李 博 楊志萍 綦國紅 王歲樓

花生肽對衰老模型大鼠血清和心、腦組織抗氧化效果的影響

陳貴堂1趙立艷2李 博1楊志萍1綦國紅1王歲樓1

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院食品質(zhì)量與安全教研室1，南京 210009)
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院2，南京 210095)

為研究花生肽的體內(nèi)抗氧化效果，將50只SD大鼠隨機分為5組(對照組、模型組、低中高劑量花生肽組)，除對照組外，其余各組大鼠按其體重每天皮下注射D－半乳糖400 mg/kg建立衰老模型，同時3個花生肽組每天分別按200、500、800 mg/kg的劑量灌胃，持續(xù)50 d。檢測大鼠血清和心、腦組織中丙二醛或脂褐質(zhì)(LF)含量以及抗氧化酶活力。結(jié)果表明，花生肽能夠有效抑制半乳糖致衰老大鼠體重的下降，減緩胸腺指數(shù)和腦指數(shù)的下降，提高大鼠血清、腦組織中SOD和GSH－Px活性，并能夠降低大鼠血清MDA含量和腦中的LF含量，表明花生肽具有顯著的抗氧化作用。

花生肽 D－半乳糖 大鼠 抗氧化

為了降低自由基的傷害，細胞內(nèi)有很多抗氧化系統(tǒng)，包括酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，然而隨著年齡增長、疲勞以及機體發(fā)生病變等狀態(tài)下，該抗氧化系統(tǒng)的防御能力會隨之降低，而導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原失衡。為了彌補體內(nèi)抗氧化能力的損失，一方面可強化體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，如提高SOD的活性或谷胱甘肽的含量等，另一方面則可補充體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，故營養(yǎng)學(xué)家一直希望找到具有抗氧化性的天然產(chǎn)物以期能用以維持體內(nèi)氧化還原的平衡。

近十幾年來，源于食物蛋白的抗氧化多肽研究日益增多，其抗氧化活性的評價方法也從體外試驗向動物體內(nèi)試驗方向發(fā)展，因為它們真正的生物學(xué)效能只有通過人體試驗或動物試驗才能得以闡明。然而，若在人體上進行這一漫長衰老過程的研究及對生物抗氧化劑進行療效觀察是不易做到的。因此，人們根據(jù)衰老的機制建立了許多動物衰老模型。其中D－半乳糖所致的亞急性衰老模型，可引起心、肝、腎、腦等重要器官的代謝異常，類似人類自然衰老時的表現(xiàn)［1］，所以在抗氧化物質(zhì)的活性評價方面得到了廣泛的應(yīng)用［2－4］。

陳貴堂等［5－7］采用多種試驗方法評價了 Alcalase酶解花生蛋白所得花生肽的生物活性，表明花生肽具有很強的抗氧化能力。為進一步研究花生肽在體內(nèi)的生理活性，本試驗采用D－半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型，通過研究花生肽對衰老模型大鼠血清和心、腦組織抗氧化作用的影響，探討花生肽在體內(nèi)抗氧化活性的作用模式，為花生抗氧化肽乃至花生餅粕的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

SPF級雄性SD大鼠:中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心，許可證號SCXK11－00－0010;大鼠普通飼料:北京科澳協(xié)力飼料有限公司;D－半乳糖:分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司;花生肽:自制［8］;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)、過氧化氫酶(CAT)以及考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。

1．2 儀器與設(shè)備

全塑動物代謝籠:自制;101－3E電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海實驗儀器廠有限公司;Lambda 7紫外可見分光光度計、Ls－5熒光光度計:美國P．E公司;Sartorius電子天平:德國哥廷根賽多利斯股份有限公司;LDZ5－2自動平衡離心機:北京醫(yī)用離心機廠。

1．3 方法

1．3．1 動物分組及處理

根據(jù)體重將大鼠隨機分為5組，即對照組、D－半乳糖致衰老模型組，低、中、高劑量花生肽組。除對照組外，每天給各組大鼠皮下注射D－半乳糖400 mg/kg BW，給對照組大鼠皮下注射等量生理鹽水，同時每天分別按200、500、800 mg/kg BW的劑量給低、中、高劑量花生肽組大鼠灌胃，對照組及模型組用等量蒸餾水灌胃，每天稱重1次。于空調(diào)動物實驗室內(nèi)，在全塑代謝籠內(nèi)單獨飼養(yǎng)，采用對喂法，保證每只大鼠每天食物攝入量相等。

在第50天禁食12 h后，大鼠斷頭取血，3 000 r/min離心15 min分離出血清，用于SOD、GSH－Px、CAT活性及MDA含量的測定。解剖大鼠，迅速取出腦、心臟、脾臟及胸腺，剔除其表面的脂肪膜，用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙將水分吸去，然后稱重，置潔凈塑料袋內(nèi)密封，低溫保存待測。

1．3．2 臟器指數(shù)計算

臟器指數(shù)(g/100 g)=臟器質(zhì)量×100/大鼠體重

1．3．3 血清及心、腦組織中SOD活力測定

用黃嘌呤氧化酶法［8］測定。取血清30μL進行測定;心、腦組織用預(yù)冷的生理鹽水制成10%勻漿，低溫下3 000 r/min離心10 min，取上清液測定SOD活性。按試劑盒操作規(guī)程進行。以每毫升血清或每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U)。

1．3．4 血清及心、腦組織中GSH－Px活力測定

用DTNB顯色法［9］測定。血清用生理鹽水稀釋5倍，取0．1 mL進行測定;心、腦組織用預(yù)冷的生理鹽水制成 10%勻漿，低溫下 3 000 r/min離心10 min，取上清液進行測定，按試劑盒操作規(guī)程進行。以每毫升血清或每毫克組織蛋白在37℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中 GSH濃度降低1μmol/L為一個活力單位(U)。

1．3．5 血清及心、腦組織中CAT活力測定

用鉬酸銨法［10］測定。取 0．1 mL 血清或 0．05 mL經(jīng)生理鹽水稀釋的1%心、腦組織勻漿，按試劑盒操作程序加入試劑，測定其在405 nm處的吸光值，按公式計算CAT活力，以每毫升血清或每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmoL的H2O2為一個活力單位(U)。

1．3．6 血清中MDA含量測定

用硫代巴比妥酸(TBA)比色法［11］。取血清0．2 mL，按試劑盒操作程序加入試劑，反應(yīng)終體積為4．4 mL，反應(yīng)管振蕩混勻后在水浴中煮沸40 min，然后3 500 r/min離心10 min，取上清液在532 nm處測定其吸光值，根據(jù)公式計算MDA含量。

1．3．7 心、腦組織中脂褐質(zhì)含量測定

參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003)［12］規(guī)定方法略加修改進行測定。取組織200 mg，加入定量蒸餾水用勻漿器制成5%的組織勻漿，然后加入4．0 mL于50℃預(yù)熱的2∶1氯仿/甲醇混合液，用旋渦振蕩器充分混勻，3 000 r/min離心10 min后樣品分為3層，上層為水相，中層為組織，下層為氯仿甲醇相。小心吸去水層，用帶長麻醉針頭的注射器沿管壁穿過中層，將下層氯仿甲醇提取液吸出。向提取液中加入甲醇0．2 mL，輕輕振蕩混勻，置紫外燈下照射30 s，倒入石英杯中，以0．1μg/mL的硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)對照，氯仿甲醇混合液為空白對照，在狹縫 4．4，靈敏度 3．6，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm下測定樣品的熒光強度。

組織中脂褐質(zhì)(Lipofuscin，LF)含量計算公式:

LF含量(μg/g組織)=(樣品熒光強度－空白熒光強度/硫酸奎寧熒光強度)×硫酸奎寧濃度×(勻漿體積/樣品質(zhì)量)

1．3．8 心、腦組織中蛋白質(zhì)含量測定

用福林－酚法［13］測定，以小牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1．3．9 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以(珋x±s)表示，用SPSS11．0軟件包進行方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié)果與分析

2．1 大鼠的生長狀況

在整個飼養(yǎng)周期，包括致衰老模型組大鼠在內(nèi)，所有大鼠食欲良好，體重均呈增長趨勢，無感染、腹瀉等異常癥狀，其體重變化如表1所示。各組大鼠初始平均體重基本相同，組間無顯著差異(P＞0．05)，給予不同的處理后，各組大鼠生長速度各不相同，其中對照組體重增加最快，衰老模型組體重增加最慢，經(jīng)給予花生肽后，大鼠的生長速度隨著肽劑量的增加而增加。至飼養(yǎng)結(jié)束時，中、高劑量組大鼠體重及食物轉(zhuǎn)化率與對照組無明顯差異，而顯著高于衰老模型組(P＜0．05)。

表1 體重增加量及食物轉(zhuǎn)化率

表2 花生肽對大鼠臟器重量及臟器指數(shù)的影響

2．2 花生肽對大鼠臟器重量及臟器指數(shù)的影響

由表2可見，大鼠心臟、脾臟質(zhì)量及其臟器指數(shù)在各組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。與對照組相比，衰老模型大鼠腦和胸腺質(zhì)量以及腦指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P＜0．05)，而與衰老模型組相比，高劑量花生肽組大鼠腦指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著增高(P＜0．05)，而中、低劑量花生肽對大鼠腦指數(shù)和胸腺指數(shù)的增高作用不明顯(P＞0．05)。

2．3 花生肽對大鼠血清 SOD、GSH－Px、CAT活性和MDA含量的影響

如表3所示，衰老模型組大鼠血清MDA含量極顯著高于對照組(P＜0．01)，SOD活性和GSH－Px活性顯著低于對照組(P＜0．05)，CAT活性雖低于對照組，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。中、高劑量組花生肽組血清SOD活性和GSH－Px活性顯著高于衰老模型組，其GSH－Px活性甚至顯著高于對照組，MDA含量顯著低于衰老模型組(P＜0．05)。低劑量花生肽組血清SOD活性、CAT活性以及MDA含量與衰老模型組無顯著差異(P＞0．05)，但其GSH－Px活性卻遠遠低于其他4組(P＜0．01)。

表3 大鼠血清SOD、GSH－Px、CAT活性和MDA含量

2．4 花生肽對大鼠心臟 SOD、GSH－Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量的影響

如表4所示，各組大鼠心臟SOD、CAT活性以及脂褐質(zhì)含量之間均無明顯差異(P＞0．05)，衰老模型組和低劑量花生肽組大鼠GSH－Px活性顯著低于對照組(P＜0．05)，中、高劑量花生肽組GSH－Px活性低于對照組，而高于衰老模型組和低劑量組，但與它們之間均無顯著差異(P＞0．05)。

表4 大鼠心臟SOD、GSH－Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量

2．5 花生肽對大鼠腦 SOD、GSH－Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量的影響

如表5所示，衰老模型組大鼠腦脂褐質(zhì)含量極顯著高于對照組(P＜0．01)，SOD活性和GSH－Px活性顯著低于對照組(P＜0．05)。中、高劑量花生肽組腦SOD活性略低于對照組，但顯著高于衰老模型組(P＜0．05);高劑量花生肽組腦GSH－Px活性略低于對照組，但顯著高于衰老模型組(P＜0．05);中、低劑量花生肽組GSH－Px活性略高于衰老模型組，但低于對照組和高劑量花生肽組，其差異均不顯著(P＞0．05)。各組大鼠腦CAT活性雖然差別很大，但因為個體差異較大而無統(tǒng)計學(xué)意義。中、高劑量組大鼠腦LF含量顯著低于衰老模型組(P＜0．05)，而與對照組無顯著差異(P＞0．05)。

表5 大鼠腦SOD、GSH－Px、CAT活性和脂褐質(zhì)含量

3 討論與結(jié)論

3．1 D－半乳糖致衰老動物模型的建立

目前D－半乳糖誘導(dǎo)的動物模型已成為抗氧化、延緩衰老藥物及保健食品篩選工作中經(jīng)常選用的試驗動物模型，動物試驗必測指標(biāo)為動物體重、過氧化脂質(zhì)含量(MDA或LF)以及抗氧化酶活性(SOD和GSH－Px)，如果過氧化脂質(zhì)含量升高和任一抗氧化酶活性降低，即可判定該受試樣品抗氧化功能動物試驗結(jié)果陽性［13］。本研究中給成年SD雄性大鼠連續(xù)頸背部皮下注射D－半乳糖7周后，衰老模型組大鼠的血清MDA及腦LF含量明顯高于對照組，同時血清SOD、GSH－Px活性及腦SOD、GSH－Px的活性顯著降低，說明本試驗動物模型建造成功。

3．2 花生肽對大鼠體重和臟器指數(shù)的影響

研究表明，試驗動物給予過量半乳糖后，生長遲緩，體重減輕［14－15］，本研究也得到了同樣的結(jié)果，但花生肽的補充可有效抵抗大鼠體重的下降。許多學(xué)者認為免疫系統(tǒng)功能下降是衰老的主要原因和標(biāo)志。陳海英等［16］在研究健康大鼠衰老指標(biāo)的增齡變化及形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的相關(guān)性研究中觀察到老年大鼠胸腺的重量和胸腺指數(shù)明顯低于青年大鼠和幼年大鼠;葛斌等［17］和陳貴堂等［6］前期的研究也發(fā)現(xiàn)，連續(xù)頸背部皮下注射D－半乳糖4～7周后，小鼠的胸腺和脾臟發(fā)生萎縮，重量明顯減輕，表明半乳糖能致動物免疫器官老化及其功能下降，這可能是引起動物早衰的原因之一。本研究結(jié)果顯示，D－半乳糖誘發(fā)的衰老模型大鼠脾臟重量和脾臟指數(shù)無明顯差異，但胸腺重量和胸腺指數(shù)均顯著降低，這說明胸腺對半乳糖的反應(yīng)可能比脾臟更明顯，或者大鼠對半乳糖的耐受能力比小鼠強。另外，D－半乳糖誘發(fā)的衰老模型大鼠腦重量和腦指數(shù)顯著低于正常組，說明D－半乳糖能夠致使大鼠腦萎縮和重量減輕。補充高劑量花生肽(800 mg/kg BW)的大鼠，其胸腺指數(shù)和腦指數(shù)與對照組相差無幾，并且顯著高于衰老模型組，表明一定劑量的花生肽能明顯對抗胸腺和腦的退化，提高免疫功能，抑制大鼠早衰。

3．3 花生肽對血清MDA及心、腦LF的影響

LF沉積是機體衰老的重要特征之一，而MDA是LF形成過程的中間產(chǎn)物，它能間接反映機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平。大量試驗證實，衰老時MDA水平或LF含量顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)D－半乳糖可以誘發(fā)模型動物血清的MDA含量顯著升高，腦組織LF沉積明顯增加。而補充高劑量花生肽(800 mg/kg BW)后，可顯著降低血清MDA和腦LF含量，提示花生肽可作為外源性的抗氧化物質(zhì)，能夠促進機體產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，抑制脂質(zhì)過氧化損傷，起到延緩衰老的作用。

3．4 大鼠血清和心、腦組織中抗氧化酶活性的變化

SOD、GSH－Px和CAT是體內(nèi)重要的三大酶類抗氧化劑，SOD能使超氧自由基歧化為過氧化氫和氧，CAT可使過氧化氫分解成為水和氧，GSH－Px可催化還原型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷墓入赘孰模瑥亩毎械挠袡C或無機的過氧化物。本試驗結(jié)果表明，D－半乳糖致衰老模型大鼠血清、腦組織中SOD和GSH－Px活性顯著降低。3個劑量花生肽組能不同程度抑制血清和腦組織中SOD和GSH－Px活力下降，其量效關(guān)系均呈正相關(guān)，提示花生肽可通過增強體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，花生肽能夠有效抑制半乳糖致衰老大鼠體重的下降，減緩胸腺指數(shù)和腦指數(shù)的下降;能夠提高D－半乳糖致衰老大鼠血清、腦組織中SOD和GSH－Px活性，并能夠降低大鼠血清MDA含量和腦中的LF含量，表明花生肽具有顯著的抗氧化作用，但其作用大小與其劑量有直接關(guān)系。

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Antioxidative Effect of Peanut Polypeptide in Serum，Heart and Brain of D－galactose－induced Aging Rats

Chen Guitang1Zhao Liyan2Li Bo1Yang Zhiping1Qi Guohong1Wang Suilou1
(College of Pharmacy，China Pharmaceutical University1，Nanjing 210009)
(College of Food Science and Tech－nology，Nanjing Agricultural University2，Nanjing 210095)

To research the antioxidantive effects of peanut polypeptides(PP)，fifty SD rats were randomly divided into five groups，namely control，model and three PP－ treated groups．Except the control group，all other groups were subcutaneously injected with D －Gal solution(40 mg/mL，0．1 mL/10g mb)daily for successive 50 days．On the same time，rats in the PP treatment groups were orally given PP in the dosage of 200 mg/kg mb，500 mg/kg mb and 800 mg/kg mb，respectively．Then the MDA or lipofuscin(LF)contents，superoxide dismutase(SOD)，glutathione peroxidase(GSH－Px)and catalase(CAT)activities in serum，heart and brain were analyzed respectively．The results showed that D－Gal－induced aging rats model was successfully established．PPsignificantly increased the thymus index and brain index，the levels of SOD，GSH－Px in serum and brain，and obviously decreased the MDA content in serum and LF content in brain in a dosedependent manner．It indicated PPhad an excellent antioxidative action in aging rats induced by D－ Gal．

peanut polypeptide，D－ galactose，rat，antioxidative effect

TQ936．16

A

1003－0174(2012)01－0043－05

2011－04－07

陳貴堂，男，1977年出生，副教授，博士，食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)

趙立艷，女，1977年出生，副教授，食品營養(yǎng)