沙棘籽原花青素提取物對小鼠免疫調(diào)節(jié)實驗研究

鄒元生，徐 瑞，溫中平，顧玉凱，徐一丹，樊柏林

（1.高原圣果沙棘制品有限公司，北京 100037；2.湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430079）

現(xiàn)代藥理研究表明，原花青素具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗癌、抗炎、抗過敏、抗病毒、保護心血管、保護肝腎功能、調(diào)節(jié)機體免疫力等生物藥理活性，此外還有改善視力、營養(yǎng)皮膚和美容、促進毛發(fā)生長等作用［1－5］。國內(nèi)外對原花青素的提取及活性研究多集中在葡萄、蘋果、蓮房等原料。從沙棘中提取原花青素的研究報道很少。

沙棘富含近200種營養(yǎng)及生物活性成分，原花青素是其中主要有效成分之一［6］。但國內(nèi)目前對沙棘開發(fā)與利用的研究多是關(guān)于沙棘中維生素、脂肪酸、黃酮等營養(yǎng)活性成分，對沙棘中原花青素的活性研究很少，對沙棘籽原花青素提取物研制成保健食品尚屬空白。本項目通過研究沙棘籽原花青素提取物對小鼠ConA誘導的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、DNFB誘導遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、血清溶血素的測定、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗、小鼠碳廓清試驗、臟器體重比的影響，旨在研究沙棘籽原花青素提取物對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用，將其研制成增強免疫力軟膠囊保健食品，其結(jié)果報告如下：

1 材料與方法

1.1 樣品來源及處理

高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊，內(nèi)容物為棕色油乳狀液體，來源于高原圣果沙棘制品有限公司，人體推薦日攝入量為0.0433g／kg BW。

樣品配制：準確稱取受試物2.165g、4.335 g、6.500g，分別用大豆油 （溶劑）定容至100mL，作低、中、高劑量組小鼠灌胃用供以下試驗用。

1.2 實驗動物及環(huán)境

SPF級昆明種雌性小鼠，18～22g，由湖北省實驗動物研究中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （鄂）2003～0005；實驗動物使用許可證號：SYXK （鄂）2003－0014。動物飼養(yǎng)室溫度為20℃～25℃，濕度為40%～70%。

1.3 劑量分組

按人體推薦日攝入量0.0433／kg BW擴大10、20、30倍設(shè)置低、中、高3個劑量組，即0.433、0.876、1.300g／kg BW，共分4個實驗組，每實驗組包括陰性對照組和溶劑對照組、低、中、高劑量組，各劑量組實驗動物數(shù)為10只。免疫實驗一組進行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗；免疫實驗二組進行淋巴器官／體重比值測定和碳廓清實驗；免疫實驗三組進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗；免疫實驗四組進行血清溶血素的測定和抗體生成細胞檢測。小鼠連續(xù)灌胃30d后開始試驗。各實驗組均按0.20ml／10g BW容量經(jīng)口灌胃給予，陰性對照組給予蒸餾水，溶劑對照組給予大豆油。

1.4 試驗方法

1.4.1 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗

方法：無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心10min（1000r／min）。然后將細胞懸浮于1mL的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù) （應(yīng)在95%以上），調(diào)整細胞濃度為3×106個／mL。將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA液（相當于7.5μg／mL），另一孔作為對照，置5%CO2，37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不合小牛血清的RPMIl640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5mg／mL）50μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔作3個平行孔， （100μL／孔）用酶標儀以570nm波長測定光密度值。

1.4.2 二硝基氟苯 （DNFB）誘導遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) （DTH）

方法：耳腫脹法。用1%DNFB（以1∶1的丙酮麻油溶液配制）致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻擊右耳，24h后處死動物剪下左右耳殼用打孔器取下直經(jīng)8mm的耳片，稱重，以左右耳的重量之差來表示DTH的程度。

1.4.3 血清溶血素的測定

方法：血凝法。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心 （2000r／min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2% （v／v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約l h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r／min離心10min，收集血清。

凝集反應(yīng)：用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔100μL，再加入100μL0.5% （v／v）SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)并加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。根據(jù)血清凝聚程度的級別計算出抗體積數(shù)。

1.4.4 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗

方法：半體內(nèi)法。制備20%的雞紅細胞懸液；每只鼠腹腔注射1mL該懸液，30min后處死動物，將其仰位固定于鼠板上，開腹，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2mL，轉(zhuǎn)動鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片載玻片上，37℃溫育30min；育畢用生理鹽水漂洗，晾干，以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干。顯微鏡下計數(shù)100個巨噬細胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù)：

1.4.5 小鼠碳廓清試驗

方法：按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁 （10mL／kg），待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并立即將其加到2mL0.1%Na2CO3溶液中。各吸0.1mL于96孔酶標板中，用酶標儀在600nm波長處測光密度值 （OD），以Na2CO3溶液作陰性對照。

將小鼠處死。取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。

以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

1.4.6 抗體生成細胞檢測

取脫纖維的羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心 （2000r／min）10min，每只鼠經(jīng)腹腔注射2% （v／v）SRBC 0.2mL。

將SRBC免疫4～5d后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有Hank’s液的小平皿內(nèi)，輕輕磨碎脾臟，制成細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，離心 （1000／min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后將細胞懸浮在5mL RPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)細胞，并將細胞濃度調(diào)整為5×106個／mL。

空斑的測定：將表層培養(yǎng)基 （1g瓊脂糖加雙蒸水至100mL）加熱溶解后，放45～50℃水浴保 溫，與等 量 pH7.2～7.4、2 倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內(nèi)加50μL 10%SRBC （v／v，用SA 緩沖液配制），20μL脾細胞懸液 （5×106個／mL），迅速混勻，傾倒于己刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5h，然后用SA緩沖液稀釋的補體 （1∶8）加人玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對小鼠體重的影響

表1、表2、表3、表4各實驗組小鼠試驗前后體重與溶劑對照組、陰性對照組比較，差異無顯著性，表明高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對小鼠體重無明顯影響。

表1 實驗一組試驗前后動物體重記錄 ±S）

表1 實驗一組試驗前后動物體重記錄 ±S）

組 別 劑 量（g／kg BW）動 物 數(shù)（只）體 重 （g）試 驗 前 試 驗 后增 重（g）陰性對照組 0.0 10 19.2±0.8 33.3±1.4 14.1±1.4溶劑對照組 0.0 10 19.2±0.8 33.3±1.1 14.2±1.0低劑量組 0.433 10 19.3±0.9 33.2±1.6 13.9±1.4中劑量組 0.867 10 19.4±1.0 33.2±1.3 13.8±1.2高劑量組1.300 10 19.8±0.8 33.4±0.8 13.6±0.9

表2 實驗二組試驗前后動物體重記錄 ±S）

表2 實驗二組試驗前后動物體重記錄 ±S）

組 別 劑 量（g／kg BW）動 物 數(shù)（只）體 重 （g）試 驗 前 試 驗 后增 重（g）陰性對照組 0.0 10 19.4±0.9 33.6±1.3 14.2±1.4溶劑對照組 0.0 10 19.1±0.8 32.7±1.1 13.6±0.9低劑量組 0.433 10 18.6±0.4 32.6±1.2 13.9±1.1中劑量組 0.867 10 19.1±1.2 32.7±1.6 13.6±1.7高劑量組1.300 10 18.9±0.9 32.7±1.1 13.7±1.2

表3 實驗三組試驗前后動物體重記錄 ±S）

表3 實驗三組試驗前后動物體重記錄 ±S）

組 別 劑 量（g／kg BW）動 物 數(shù)（只）體 重 （g）試 驗 前 試 驗 后增 重（g）陰性對照組 0.0 10 19.3±1.0 33.4±1.9 14.1±1.6溶劑對照組 0.0 10 19.3±0.6 33.0±1.2 13.7±0.9低劑量組 0.433 10 19.3±0.9 32.9±1.6 13.6±1.1中劑量組 0.867 10 19.1±0.7 32.5±1.1 13.5±1.2高劑量組1.300 10 19.2±0.6 32.5±1.0 13.3±1.2

表4 實驗四組試驗前后動物體重記錄 ±S）

表4 實驗四組試驗前后動物體重記錄 ±S）

組 別 劑 量（g／kg BW）動 物 數(shù)（只）體 重 （g）試 驗 前 試 驗 后增 重（g）陰性對照組 0.0 10 19.0±0.9 33.0±0.9 14.0±1.2溶劑對照組 0.0 10 19.2±0.8 33.1±2.1 13.9±1.6低劑量組 0.433 10 19.2±0.8 32.6±1.8 13.4±1.5中劑量組 0.867 10 19.4±0.8 33.1±1.1 13.7±1.2高劑量組1.300 10 19.4±0.8 33.2±1.2 13.8±1.0

2.2 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對動物淋巴器官／體重比值的影響

表5各組動物間胸腺／體重比值和脾臟／體重比值與溶劑對照組、陰性對照組比較，差異均無顯著性 （p＞0.05）。

表5 對動物淋巴器官／體重比值的影響 ±S）

表5 對動物淋巴器官／體重比值的影響 ±S）

注 （溶劑）表示對溶劑對照組比較，（陰性）表示對陰性對照組比較。

p值p值組 別 劑 量（g／kg BW）動物數(shù)（只）胸腺／體重比值（×10－3） 溶劑 陰性脾臟／體重比值（×10－3） 溶劑 陰性陰性對照組 0.0 10 2.71±0.22 0.962 － 3.69±0.25 0.724 －溶劑對照組 0.0 10 2.72±0.30 － 0.962 3.73±0.25 － 0.724低劑量組 0.433 10 2.67±0.21 0.681 0.662 3.74±0.33 0.894 0.665中劑量組 0.867 10 2.69±0.26 0.828 0.840 3.67±0.32 0.665 0.898高劑量組 1.300 10 2.72±0.32 0.988 0.949 3.70±0.32 0.828 0.929

2.3 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果

從表6可見，與溶劑對照組、陰性對照組比較，高劑量組顯著性增強ConA誘導的脾淋巴細胞增殖能力 （P＜0.05、P＜0.05）。

表6 沙棘花青素軟膠囊對小鼠細胞免疫功能影響 （x±S）

2.4 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

從表6可見：與溶劑對照組、陰性對照組比較，高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊高劑量組顯著性增強小鼠對DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng) （P＜0.05、P＜0.05）。

2.5 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對小鼠血清溶血素滴度水平的影響

從表7可見，與溶劑對照組、陰性對照組比較，高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊高劑量組可顯著性升高血清溶血素含量 （P＜0.05、P＜0.05）。

表7 沙棘花青素軟膠囊對小鼠溶血素滴度水平的影響 ±S）

表7 沙棘花青素軟膠囊對小鼠溶血素滴度水平的影響 ±S）

注 （溶劑）表示對溶劑對照組比較，（陰性）表示對陰性對照組比較。

組 別 劑 量（g／kg BW）動 物 數(shù)（只）血清溶血素（抗體積數(shù)）P值溶 劑 陰 性1.300 10 71.3±11.6 0.016 0.031陰性對照組 0.0 10 56.4±14.3 0.997 －溶劑對照組 0.0 10 55.0±11.1 － 0.997低劑量組 0.433 10 61.5±13.5 0.579 0.756中劑量組 0.867 10 64.1±10.0 0.290 0.433高劑量組

2.6 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能的影響

從表8可見，與溶劑對照組、陰性對照組比較，高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊高劑量組明顯提高吞噬率和吞噬指數(shù) （P＜0.05、P＜0.05）。

表8 沙棘花青素軟膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 ±S）

表8 沙棘花青素軟膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 ±S）

注 （溶劑）表示對溶劑對照組比較，（陰性）表示對陰性對照組比較。

組 別 劑 量（g／kg.BW）動物數(shù)（只）吞噬百分率（%）p值p值吞噬指數(shù)溶 劑 陰 性 溶 劑 陰 性.011 0.027陰性對照組 0.0 10 22.40±2.27 1.000 － 0.321±0.034 0.989 －溶劑對照組 0.0 10 22.20±2.30 － 1.000 0.315±0.022 － 0.989低劑量組 0.433 10 23.90±3.07 0.517 0.601 0.335±0.029 0.567 0.813中劑量組 0.867 10 25.10±3.87 0.135 0.172 0.340±0.049 0.373 0.609高劑量組 1.300 10 26.00±3.20 0.030 0.040 0.367±0.044 0

2.7 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對碳廓清功能的影響

從表9可見，與溶劑對照組、陰性對照組比較，高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊高劑量組顯著性提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù) （P＜0.05、P＜0.05）。

表9 沙棘花青素軟膠囊對小鼠碳廓清功能的影響 ±S）

表9 沙棘花青素軟膠囊對小鼠碳廓清功能的影響 ±S）

注 （溶劑）表示對溶劑對照組比較，（陰性）表示對陰性對照組比較。

組 別 劑 量（g／kg BW）動 物 數(shù)（只） 吞噬指數(shù)a P值溶 劑 陰 性1.300 10 6.13±0.58 0.024 0.031陰性對照組 0.0 10 5.39±0.51 1.000 －溶劑對照組 0.0 10 5.36±0.77 － 1.000低劑量組 0.433 10 5.85±0.70 0.227 0.268中劑量組 0.867 10 5.97±0.43 0.094 0.116高劑量組

2.8 高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊對抗體生成細胞功能的影響

從表10見，與溶劑對照組、陰性對照組比較，高原圣果牌沙棘花青素軟膠囊高劑量組能明顯增強抗體生成細胞能力 （P＜0.01、P＜0.05）。

表10 沙棘花青素軟膠囊對抗體生成細胞功能的影響 ±S）

表10 沙棘花青素軟膠囊對抗體生成細胞功能的影響 ±S）

注 （溶劑）表示對溶劑對照組比較，（陰性）表示對陰性對照組比較。

組 別 劑 量（g／kg BW）動 物 數(shù)（只）溶血空斑數(shù)（／106 脾細胞）p值溶 劑 陰 性1.300 10 208.0±25.73 0.010 0.039陰性對照組 0.0 10 177.0±20.58 0.961 －溶劑對照組 0.0 10 171.0±24.70 － 0.961低劑量組 0.433 10 197.0±24.97 0.102 0.273中劑量組 0.867 10 200.0±33.67 0.058 0.171高劑量組

3 結(jié)論

（1）沙棘籽原花青素提取物能明顯增強ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖能力；

（2）沙棘籽原花青素提取物能明顯增強二硝基氟苯誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；

（3）沙棘籽原花青素提取物能明顯升高小鼠血清溶血素含量；

（4）沙棘籽原花青素提取物能明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能；

（5）沙棘籽原花青素提取物能明顯增強小鼠碳廓清能力；

（6）沙棘籽原花青素提取物能明顯增強抗體生成細胞能力；

（7）沙棘籽原花青素提取物在提高小鼠免疫力的同時沒有負面影響。

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