雙黃花片HPLC指紋圖譜的研究及其綠原酸和黃芩苷含量測定

王 華，蔡 萍，萬 丹

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南省中醫(yī)藥研究院超微工程中心，湖南 長沙410013）

雙黃花片由金銀花、黃芩、黃芪等中藥組成，具有抗流感病毒之功效[1-2]。臨床主要用于治療流感，療效可靠且毒副作用較小。中藥制劑指紋圖譜已廣泛應用于中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，尤其適合中藥材和中藥提取物的整體質(zhì)量評價。本文采用高效液相色譜法建立10 批雙黃花片指紋圖譜，比較不同批次雙黃花片的相似度，以完善雙黃花片的質(zhì)量標準。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 全自動高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括四元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器。AE-240 型分析天平（METTLER）。

1.2 對照品與樣品

綠原酸對照品（批號：110753-200212）；黃芩苷照品（批號：110715-200212）均由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用。10 批雙黃花片由湖南省中醫(yī)藥研 究 院 提 供，批號 分 別 為20100101、20100102、20100103、20100104、20100105、20100106、20100107、20100108、20100109、20100110。

1.3 試劑

甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相；按表1進行梯度洗脫。

表1 流動相洗脫梯度

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品6.4 mg，加50%甲醇制得濃度為0.064 mg/mL 的綠原酸對照品溶液。精密稱取黃芩苷對照品9.2 mg，加甲醇制得濃度為0.092 mg/mL 的黃芩苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品約0.1 g，精密稱定，置于250 mL 容量瓶圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，置水浴加熱回流30 min，放冷，移置100 mL 容量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇定容，振蕩混勻后，濾過，吸取濾液過0.45 μm 微孔濾膜，備用。

2.4 參照峰的選擇

黃芩苷是本制劑有效成分之一，在HPLC 圖譜中峰面積大，出峰時間適中且穩(wěn)定，故選擇黃芩苷為參照峰[3]。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密量取綠原酸對照品溶液4、6、8、10、12 μL，黃芩苷對照品溶液2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件測定。以對照品進樣量為橫坐標，相應峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 綠原酸和黃芩苷線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液5 μL，連續(xù)進樣6 次，記錄指紋圖譜。以6 號峰黃芩苷為參照峰，各共有色譜峰保留時間的RSD 值均在0.5%以下，各共有色譜峰相對峰面積間的RSD 值均在5.0%以下，根據(jù)峰面積計算，綠原酸、黃芩苷的RSD 分別為0.51%、0.85%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，記錄指紋圖譜。以6 號峰黃芩苷為參照峰，各共有色譜峰保留時間的RSD 值均在0.5%以下，各共有色譜峰相對峰面積間的RSD 值均在5.0%以下，根據(jù)峰面積計算，綠原酸、黃芩苷的RSD 分別為0.38%、1.33%，表明樣品溶液在12 h 內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗 取同一批樣品6 份 （批號：20100101），按供試品制備方法進行制備，記錄指紋圖譜。結(jié)果，各共有色譜峰保留時間的RSD 值均在0.5%以下，各共有色譜峰相對峰面積間的值均在5.0%以下，根據(jù)峰面積計算，綠原酸、黃芩苷的RSD分別為0.63%、0.77%，結(jié)果表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品 (批號：20100101)約0.05 g，精密稱定，分別精密加入適量綠原酸、黃芩苷對照品，按“2.3” 項下操作，結(jié)果綠原酸的平均加樣回收率為97.16%，RSD 為1.47%；黃芩苷的平均加樣回收率為97.23%，RSD為1.30%。結(jié)果表明，本方法加樣回收率良好，見表3～4。

表3 綠原酸加樣回收率測定 （mg）

表4 黃芩苷加樣回收率測定 （mg）

2.6 指紋圖譜的建立

將各供試品溶液注入高效液相色譜儀，測定各樣品的HPLC 指紋圖譜，經(jīng)比較分析，確定10 個色譜峰為雙黃花片的共有峰，見圖1。通過與對照品圖譜（圖2）比較，表明3 號峰為綠原酸，6 號峰為黃芩苷。

2.7 指紋圖譜相似度的計算

采用中國藥典委員會出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價》軟件（2.0 版）對10 批樣品進行相似度評價。設置第一批樣品圖譜為參照物圖譜，時間窗0.5，中位數(shù)法，多點校正后自動匹配，生成對照指紋圖譜（見圖1），10 批樣品的相似度達到0.8 以上，相似度計算結(jié)果見表5。

圖1 雙黃花片10 批樣品的HPLC 圖譜及對照指紋圖譜

圖2 綠原酸、黃芩苷對照品及雙黃花片樣品HPLC 圖

表5 10 批雙黃花片樣品指紋圖譜相似度

2.8 含量測定

按“2.3”項下方法制備供試品溶液并測定，結(jié)果見表6。

表6 10 批雙黃花片樣品中綠原酸、黃芩苷的含量測定 （%）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

比較了乙腈-水、乙腈-0.4 mol/L 磷酸水溶液及乙腈-0.2 mol/L 磷酸水溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加了磷酸的流動相峰形較好，0.2%與0.4%的磷酸水溶液相比，出峰情況相似，所以采用乙腈-0.2 mol/L 磷酸水溶液的流動相。樣品在280 nm 有較強的吸收，并且在該波長下檢測，色譜圖峰形最好，出峰數(shù)目適中，各色譜峰相互之間分離度較好，故檢測波長定為280 nm。

3.2 特征色譜峰的選擇

研究選擇的2 個特征色譜峰，為雙黃花組方的2 味中藥金銀花、黃芩的2 種成分綠原酸和黃芩苷?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩中的黃芩苷是最主要的活性成分之一，具有較好的抗菌、抗病毒作用[4]；金銀花中的綠原酸也具有較好的抗菌、抗病毒作用[5]，故黃芩苷、綠原酸作為評價雙黃花片質(zhì)量標準的特征成分。

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[2]蔡光先，朱光葵，張水寒，等.抗病毒中草藥組合物、中藥組合物及其制備方法[P].中國專利：CN201110001291.2，2011-05-25.

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