mRNA差異顯示法篩選黃花石蒜中加蘭他敏合成相關(guān)基因

唐金鳳，魯耀邦，桂柳姿

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥藥性與藥效三級科研實(shí)驗(yàn)室，省中藥現(xiàn)代化研究實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410208）

黃花石蒜（Lycoris aurea Herb.）系石蒜屬植物，內(nèi)含生物堿、多糖、黃酮、氨基酸及凝集素等化學(xué)成分[1-3]，其中加蘭他敏含量比石蒜屬其他植物高[4]。加蘭他敏是治療阿爾茨海默氏病（AD）的首選藥物之一。臨床研究表明，加蘭他敏可明顯改善AD 患者的認(rèn)知能力且毒副作用小，其作為治療輕度至中重度AD 的藥物已在歐盟國家上市[5-7]。通過相關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)：七月份的黃花石蒜花中加蘭他敏的含量花中含量最高，莖（花葶）含量最少[8]，另有文獻(xiàn)表明花中花蕊部分加蘭他敏含量最高[9]，提示黃花石蒜不同部位中生物活性物質(zhì)加蘭他敏合成相關(guān)關(guān)鍵酶基因及加蘭他敏生物合成代謝途徑存在差異。目前加蘭他敏生物合成代謝途徑尚不明確，本實(shí)驗(yàn)以此為立題依據(jù)，借助近年來檢測基因的一種高效方法—mRNA 差異顯示技術(shù)（DD-PCR）[10]，研究黃花石蒜的花蕊與花葶的差異表達(dá)，并對其克隆進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為黃花石蒜中加蘭他敏合成代謝提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃花石蒜采自于湖南衡山，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室潘清平教授鑒定為石蒜科石蒜屬植物L(fēng)ycoris aurea Herb.。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒購自TIANGEN 公司；26 條隨機(jī)引物和3 條錨定引物購自上海生物工程有限公司；反 轉(zhuǎn) 錄 酶M-MLV，RNasin Inhibitor 購 自Promega 公司；QIAEX Gel Extraction Kit 購自美國QIAGEN 公 司；PMD19-T Vector 購 自TaKaRa 公司。

1.3 方法

1.3.1 黃花石蒜花蕊與花葶總RNA 的提取 參照TIANGEN 植物總RNA 提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作[11]。

1.3.2 cDNA 合成 參照M-MLV 試劑說明書操作，反轉(zhuǎn)錄所用的錨定引物與PCR 所用的錨定引物一致，最后將合成的cDNA 保存于-20 ℃。

1.3.3 差異顯示PCR 用3 種錨定引物與26 種隨機(jī)引物的不同組合，分別以花蕊和花葶的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為底物進(jìn)行156 個(gè)PCR 反應(yīng)[11]。

1.3.4 差異顯示片段的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） PCR 產(chǎn)物在6%PAGE 膠上電泳，將PCR產(chǎn)物與6×loading buffer 以4∶1 比例混勻，上樣，以8V/cm 的恒定電壓電泳至溴酚藍(lán)移出膠外，二甲苯氰FF 離膠底部1.5 cm 處，停止電泳。對凝膠進(jìn)行染色參照梁宏偉等[12]改良的銀染方法，于26 ℃60 r/min 震蕩箱中振搖顯影。用GIS-1000B Tanon 凝膠成像系統(tǒng)觀察照相并保存圖片。

1.3.5 PAGE 電泳差異顯示片段的回收及回收片段的第二次PCR 反應(yīng) 參照王永成等[13]的方法略有改進(jìn)，用無菌水清洗膠若干次，將差異條帶用消毒后的手術(shù)刀片切下并編號；用無菌水清洗條帶2 次，每次200 μL；用滅菌的Tip 頭將膠碾碎；加入30 μL無菌水，用封口膜將管口封嚴(yán)；沸水中煮8 min；4 ℃12 000 r/min 離心2 min，取3～4 μL 上清液進(jìn)行第二次PCR，第二次PCR 反應(yīng)體系與條件同第一次PCR 反應(yīng)。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.3.6 回收片段的克隆 （1）回收片段二次PCR 產(chǎn)物的純化：參考QIAGEN 的瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書中具體步驟進(jìn)行。（2） 純化產(chǎn)物的連接反應(yīng)：參照TaKaRa 公司的PMD19-T Vector 說明書進(jìn)行操作。（3）克?。簠⒄仗战艿萚14]的方法進(jìn)行。將克隆所得的陽性菌液送上海博尚公司進(jìn)行測序。

1.3.7 差異顯示片段序列比對及分析 在GenBank數(shù) 據(jù) 庫（網(wǎng) 址 為：http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中，將所測序列通過BLASTN 軟件及BLASTX 軟件進(jìn)行分析，尋找與其它蛋白序列的同源性。

2 結(jié)果

2.1 mRNA 差異顯示PCR

以隨機(jī)引物與錨定引物配對，擴(kuò)增cDNA，用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異條帶，如圖1所示。

圖1 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 差異條帶的第二次擴(kuò)增及凝膠回收

從6%聚丙烯酰胺凝膠中回收差異條帶，并進(jìn)行第二次PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)其為單一條帶，如圖2所示。通過QIAGEN 公司提供的普通瓊脂糖凝膠電泳DNA 回收試劑盒回收差異條帶用于克隆。

圖2 差異條帶瓊脂糖凝膠回收電泳圖

2.3 差異條帶克隆及轉(zhuǎn)化子的鑒定

將回收的差異DNA 條帶連接至PMD19-T 載體中，轉(zhuǎn)化后，將菌落進(jìn)行PCR，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)重組質(zhì)粒中含有插入的目的基因片段（如圖3）。

圖3 目的基因的鑒定電泳圖

2.4 差異條帶的序列分析及同源性比較

本試驗(yàn)最終得到44 條差異條帶，通過BLASTN數(shù)據(jù)庫及BLASTX 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其中C290115 與快速堿化因子前體、C270614-2 與脫乙酰酶組蛋白14、C271212-2 與I 類熱休克蛋白有較高的同源性。BLASTN 及BLASTX 比對如表1。

表1 差異片段在GenBank 中Blastn 及Blastx 分析

3 討論

目前，對黃花石蒜的研究主要致力于愈傷組織培養(yǎng)[15-17]和化學(xué)成分[1-3]及植物組織中加蘭他敏的定位方面[18]，而未見加蘭他敏生物合成代謝途徑方面的研究報(bào)道。本試驗(yàn)旨在從基因轉(zhuǎn)錄水平研究加蘭他敏生物合成代謝途徑。我國20世紀(jì)60年代開始石蒜堿高含量植物的尋找工作，對石蒜屬植物鱗莖中加蘭他敏的含量測定的結(jié)果表明，黃花石蒜為石蒜屬植物中加蘭他敏的含量最高的物種之一[19]。7月份黃花石蒜花中加蘭他敏含量最高，根次之，鱗莖和莖（花葶）中含量最少[8]，此結(jié)果與李子璇等[9]發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，說明這個(gè)時(shí)期同一生存條件下石蒜中的加蘭他敏主要富集于生殖器官，尤其花蕊中；8月份的黃花石蒜不同部位中加蘭他敏主要集中在鱗莖中，須根、葉、花、花苔中則含量較少[21]，說明這一時(shí)期下鱗莖是加蘭他敏的主要儲(chǔ)存部位。本試驗(yàn)通過比較7月份的黃花石蒜花蕊和花葶的基因轉(zhuǎn)錄水平上存在差異，篩選出的三個(gè)同源序列中其中快速堿化因子前體基因和脫乙酰酶組蛋白14 基因同源序列可能與加蘭他敏的生物合成代謝途徑有關(guān)，其功能的驗(yàn)證有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。在黃花石蒜的花蕊中還克隆出熱休克蛋白基因，推測其可能因外界氣溫的變化而調(diào)控加蘭他敏的代謝及運(yùn)輸，此結(jié)果有待進(jìn)一步研究。差異顯示DD-PCR 克隆出的44 個(gè)差異條帶中，大部分為未知，有待進(jìn)一步驗(yàn)證及分析。

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