九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉腸易激綜合征模型大鼠AQP4、PKA與cAMP表達(dá)的影響

譚 潔，滕久祥，彭芝配，馬 薇，殷 堅(jiān)

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208）

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是臨床上最常見的一種胃腸道功能紊亂性疾病，臨床上有腹瀉型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、腹瀉便秘交替型（IBS-A）三個(gè)亞型，而以腹瀉型居多。近年來(lái)大量文獻(xiàn)證實(shí)環(huán)腺苷酸-環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶（cAMP-PKA） 信號(hào)通路參與了水通道蛋白的表達(dá)，在IBS 病理生理過(guò)程中起重要作用。九香止瀉片是以民間驗(yàn)方為基礎(chǔ)，在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)而擬定，經(jīng)多年臨床應(yīng)用，療效確切。本研究期望通過(guò)九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉腸易激綜合征（脾胃濕熱型） 模型大鼠腸道AQP4、PKA 表達(dá)和cAMP 含量的影響來(lái)探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20）g。由上海希普爾-必凱試驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0002]。

1.1.2 藥物 （1）九香止瀉片：由秦皮、木香、白頭翁等藥組成。批號(hào)20070108，湖南德康制藥有限公司提供。將藥片碾碎后放入量杯中加0.9%生理鹽水溶解，過(guò)濾取汁，配制成含生藥1.227 g/mL 藥液，置4 ℃保存?zhèn)溆?；?） 鹽酸洛哌丁胺膠囊：2 mg/粒，批號(hào)080129233，西安楊森制藥有限公司提供，將鹽酸洛哌丁胺膠囊內(nèi)容物放入量杯內(nèi)加0.9%生理鹽水溶解，配制成0.108 mg/mL 藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑（1）烏拉坦：長(zhǎng)沙分路口化工廠生產(chǎn)，批號(hào)060109；（2）AQP4 免疫組化試劑盒：武漢博士得生物有限公司；（3）PKA 免疫組化試劑盒：武漢博士得生物有限公司；（4）cAMP 放免試劑盒：北京華英生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號(hào)：HY-093；（5）北京產(chǎn)二鍋頭：60 度；（6）高糖高脂飼料（自制，在普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜，糖脂的含量比為2∶3）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 選用40 只SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、模型組、九香止瀉片組、鹽酸洛哌丁胺對(duì)照組4 組，每組10只，所有大鼠均單只單籠飼養(yǎng)，籠底鋪上濾紙，以便觀察其大便情況。

1.2.2 造 模 及 給 藥 方 法 （1） 空 白 組：在22～25 ℃，40%～60%相對(duì)濕度的環(huán)境下，以普通飼料喂養(yǎng)；（2）其他各組：將腸易激綜合征慢性應(yīng)激動(dòng)物模型和廖氏[1]脾胃濕熱證模型相結(jié)合，自創(chuàng)濕熱泄瀉型腸易激綜合征模型[2]。造模方法：以高糖高脂飼料喂養(yǎng)；第8 天置于造模箱，箱內(nèi)溫度（32±2）℃，相對(duì)濕度90%～95%；從第15 天開始灌服北京產(chǎn)二鍋頭(2 mL/200 g，1 次/d)，共7 d；同時(shí)分別給予：禁食、禁水、夾尾、高溫環(huán)境、冷刺激、明暗顛倒、水平振蕩[2]。上述方法每7 d 為1 周期。在模型處理期間，每日僅予大鼠一種處理，順序隨機(jī)，但任何連續(xù)2 d 內(nèi)所予處理均不相同，讓大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，共持續(xù)3 周。21 d 后移出置于自然環(huán)境，12 h 后九香止瀉片組和鹽酸洛哌丁胺組分別給予藥液給藥體積10 mL/（kg·d），給藥劑量為12.27 g/(kg·d)，給藥劑量均按60 kg 成人體表面積換算，鹽酸洛哌丁胺藥液給藥體積10 mL/(kg·d)，劑量為1.08 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃7 d；空白組、模型組以等量生理鹽水10 mL/(kg·d)連續(xù)灌胃7 d。7 d 后動(dòng)物經(jīng)腹腔麻醉后取血處死，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 大鼠腸道標(biāo)本制備 取各組大鼠的回盲部、結(jié)腸（距肛門5 cm）各0.5 cm，立即用生理鹽水沖洗，10%中性緩沖福爾馬林液固定后，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2.4 一般形態(tài)學(xué)觀察 大鼠腸道蘇木素一伊紅(haematoxylin-eosin，HE)染色：取大鼠回盲部及結(jié)腸的石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，片厚4 μm，每1 個(gè)部位取2 張，HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

1.2.5 免疫組化法 大鼠腸道AQP4、PKA 表達(dá)采用免疫組化法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)鏡檢、圖像采集，利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)5 個(gè)視野灰度值，取其均值，進(jìn)行定量分析。

1.2.6 放免法 大鼠腸道cAMP 含量采用放免法進(jìn)行測(cè)定分析，按照cAMP 檢測(cè)試劑盒所要求的實(shí)驗(yàn)步驟，稱取腸組織100 mg，加入2 mL 冰醋酸勻漿后，再加入2 mL 無(wú)水乙醇，混勻，靜止5 min，3 500 r/min 離心15 min，取上清液，殘?jiān)尤?5%乙醇2 mL 洗沉淀，勻漿分散，混勻，3 500 r/min 離心15 min，合并上清液，-20 ℃保存待測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

造模后大鼠精神萎靡，倦怠，嗜臥懶動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，大便稀或溏泄，漸見肛周污穢；飲食量下降，體重增長(zhǎng)緩慢，皮毛枯槁無(wú)光澤，豎毛；IBS 模型組大鼠易激惹，糖水?dāng)z取量明顯減少，與相關(guān)文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致；九香止瀉片組與鹽酸洛哌丁胺組在分別灌服相應(yīng)藥物后，上述癥狀有明顯改善。各組大鼠結(jié)腸粘膜HE 染色結(jié)果示結(jié)腸粘膜完整，未見粘膜器質(zhì)性損害。

2.2 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道cAMP表達(dá)的影響

模型組中cAMP 的含量明顯少于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預(yù)后，九香止瀉片組、鹽酸洛哌丁胺組大鼠腸道中cAMP 的含量與模型組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組間與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

2.3 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道PKA表達(dá)的影響

模型組腸道中(回盲部、結(jié)腸遠(yuǎn)端)PKA 的表達(dá)明顯少于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預(yù)后，九香止瀉片組、鹽酸洛哌丁胺組大鼠腸道中PKA 的表達(dá)與模型組比較顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組間比較及兩組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2，圖1、2。

表1 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道cAMP 表達(dá)的影響 （±s，n=10，nmol/L）

表1 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道cAMP 表達(dá)的影響 （±s，n=10，nmol/L）

注：與空白組比較※P＜0.05；與模型組比較＃P＜0.05。

組 別空白組模型組九香止瀉片組鹽酸洛哌丁胺對(duì)照組藥物劑量（g/kg）— —12.27 1.08×10-3 cAMP 0.72±0.21 0.52±0.14※0.82±0.32＃0.90±0.43＃

表2 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道PKA 表達(dá)的影響 （±s，n=10）

表2 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道PKA 表達(dá)的影響 （±s，n=10）

注：與空白組比較※P＜0.05；與模型組比較＃P＜0.05。

組 別空白組模型組九香止瀉片組鹽酸洛哌丁胺對(duì)照組藥物劑量（g/kg）— —12.27 1.08×10-3回盲部148.93±21.30 94.28±11.87※135.19±18.91＃145.00±29.78＃結(jié)腸遠(yuǎn)端166.81±29.89 127.89±20.13※167.10±20.61＃162.31±19.15＃

圖1 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道（回盲部）PKA 表達(dá)的影響（免疫組化染色光鏡圖，×400）

圖2 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道（結(jié)腸遠(yuǎn)端）PKA 表達(dá)的影響（免疫組化染色光鏡圖，×400）

2.4 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道AQP4表達(dá)的影響

模型組腸道中(回盲部、結(jié)腸遠(yuǎn)端)AQP4 的表達(dá)明顯少于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預(yù)后，九香止瀉片組、鹽酸洛哌丁胺組大鼠腸道中AQP4 的表達(dá)與模型組比較顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。大鼠腸道中AQP4 的表達(dá)由結(jié)腸近端向結(jié)腸遠(yuǎn)端逐漸減少。結(jié)果見表3，圖3、4。

表3 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道AQP4表達(dá)的影響 （±s，n=10）

表3 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道AQP4表達(dá)的影響 （±s，n=10）

注：與空白組比較※P＜0.05；與模型組比較＃P＜0.05。

組 別空白組模型組九香止瀉片組鹽酸洛哌丁胺對(duì)照組藥物劑量（g/kg）— —12.27 1.08×10-3回盲部148.37±15.80 112.33±37.23※148.12±27.50＃146.37±32.65＃結(jié)腸遠(yuǎn)端125.73±10.09 89.37±9.40※138.63±25.84＃141.91±27.71＃

圖3 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道（回盲部）AQP4 表達(dá)的影響（免疫組化染色光鏡圖，×400）

圖4 九香止瀉片對(duì)濕熱型泄瀉IBS 大鼠腸道（結(jié)腸遠(yuǎn)端）AQP4 表達(dá)的影響（免疫組化染色光鏡圖，×400）

3 討論

腸易激綜合征（IBS）是一種常見的胃腸功能紊亂性疾病。至今，IBS 發(fā)病機(jī)制尚不清楚，近年研究發(fā)現(xiàn)，cAMP-PKA 信號(hào)通路介導(dǎo)下的AQP4 異常表達(dá)在IBS 病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)有研究顯示AQP4 在結(jié)腸中的分布表現(xiàn)為近端表達(dá)水平高于遠(yuǎn)端，黏膜頂部高于底部，細(xì)胞的基底面和腔面高于側(cè)壁，吸收細(xì)胞表達(dá)明顯而杯狀細(xì)胞無(wú)表達(dá)[4]。這種空間排列的方向性與結(jié)腸對(duì)水分的吸收具有相適應(yīng)性，研究表明結(jié)腸腺管是液體吸收的主要位點(diǎn)。王曉玲等[5]通過(guò)復(fù)制大鼠腹瀉模型研究腹瀉狀態(tài)下AQP4 的表達(dá)情況，結(jié)果提示腹瀉時(shí)升、降結(jié)腸AQP4 均較正常組減少，從病理學(xué)角度證明了水通道蛋白在結(jié)腸水重吸收中具有重要的生理學(xué)作用，這很可能是某些腹瀉相關(guān)性疾病的共同病理生理的轉(zhuǎn)歸。

同時(shí)，有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)cAMP—PKA 信號(hào)通路介導(dǎo)AQPs 的運(yùn)輸、門控以及重新分布。AQP 磷酸化為cAMP 依賴性，即在某些因素作用下，腺苷酸環(huán)化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)cAMP 增加，進(jìn)而活化PKA 或PKC，PKA 或PKC 催化水通道蛋白上的絲氨酸磷酸化，從而增加膜對(duì)水的通透性。

中醫(yī)學(xué)根據(jù)腹瀉型IBS 的臨床表現(xiàn)，與中醫(yī)學(xué)中“泄瀉”相似，其病程較長(zhǎng)，屬久瀉。其病機(jī)為脾陽(yáng)不運(yùn)，肝郁脾虛，兼夾腸中濕熱，常出現(xiàn)虛實(shí)夾雜，寒熱交錯(cuò)。九香止瀉片由秦皮、木香、白頭翁等藥組成。對(duì)濕熱泄瀉型IBS 有較好的治療作用。方中秦皮清熱燥濕，為君藥；木香行氣調(diào)中止痛，為臣藥；佐以白頭翁清熱燥濕，涼血止痢；諸藥合用具有健脾清熱燥濕，澀腸止瀉，行氣止痛之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：濕熱泄瀉型IBS 模型大鼠腸道中AQP4、cAMP 與PKA 的表達(dá)明顯減少 （P＜0.05），且大鼠腸道中AQP4 的表達(dá)由結(jié)腸近端向結(jié)腸遠(yuǎn)端呈逐漸減少趨勢(shì)[4]；給予藥物干預(yù)后，其腸道AQP4、cAMP 與PKA 的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，表明九香止瀉片可能通過(guò)激活I(lǐng)BS 模型大鼠腸道中腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP 增加，進(jìn)而活化PKA，PKA 進(jìn)一步催化AQP4 上的絲氨酸磷酸化，從而增加膜對(duì)水的通透性，促進(jìn)結(jié)腸對(duì)腸腔內(nèi)水分的重吸收，使糞便得到濃縮，從而改善腹瀉癥狀。

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