前癃通膠囊抑制良性前列腺增生基質(zhì)細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的體外實驗研究

胡金輝，周 青，黃艷茹，莫興群

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

前列腺增生癥即良性前列腺增生(BPH)，臨床以下尿路癥狀或下尿路癥狀加重以及尿路受損為主要表現(xiàn)，部分存在膀胱出口梗阻［1］。隨著社會老齡化，BPH 已成為影響男性健康的常見病、多發(fā)??；男性前列腺在青中年時開始出現(xiàn)不同程度組織學(xué)增大，隨年齡增長前列腺增生體積呈上升趨勢，而在85 歲以上患者中前列腺總體積增大高達(dá)90%［2-3］。良性前列腺增生是由基質(zhì)和上皮依不同比例混合增生的疾病，且以基質(zhì)增生為主，年齡越大，增生的基質(zhì)越多，上皮組織越少[4]。因此，對前列腺基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究具有重要意義。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)前列腺內(nèi)生長因子 TGF-/bFGF 是前列腺增生的重要直接誘因之一［5］，本實驗旨在探討前癃通膠囊對細(xì)胞分泌的TGF-β1mRNA 表達(dá)的影響；采用MTT 比色法檢測前癃通膠囊對體外培養(yǎng)良性前列腺增生前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制作用；同時應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-多酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，觀察前癃通膠囊干預(yù)下TGF-β1mRNA 在良性前列腺增生基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)的變化，現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法[6]

1.1 材料

1.1.1 藥物 前癃通膠囊：由黃芪、田三七、水蛭、丹參、穿山甲、王不留行等藥物精制而成(由湖南中醫(yī)學(xué)院附屬一醫(yī)院制劑室制成膠囊)，取前癃通膠囊粉末20 g，溶于20 mL 含血清培養(yǎng)液含生藥量6.6 g/mL，再經(jīng)過濾器過濾。

1.1.2 試劑 MTT （溴化二甲基噻唑二苯四氮唑）、DMSO （二甲基亞砜） 及胰酶均為美國Sigma 公司；1640 培養(yǎng)液（含雙抗）、PBH(磷酸緩沖液)、胎牛血清及冰醋酸均購自北京鼎盛生物工程有限公司; 良性前列腺增生原代基質(zhì)細(xì)胞購于上海拜力生物技術(shù)公司；總RNA 提取試劑盒（博大科技生物公司）。

1.1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(SHELLAB 公司)；984型低溫冰箱（Forma 公司）；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；相差倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；全自動酶標(biāo)儀（BIORAD 公司）；離心機(jī)（美國Beckman公司）；電泳儀（北京六一公司）；瓊脂糖凝膠電泳槽（北京六一公司）；核酸蛋白分析儀 （德國eppendor公司）；培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（日本Nuco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將良性前列腺增生原代基質(zhì)細(xì)胞消化到12 個96 孔板，然后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成3組，即24、48、72 h 組，貼壁生長后予以藥物處理。

1.2.2 給藥劑量及方法 96 孔板上分設(shè)空白、高濃度、中濃度、低濃度組，每個濃度組重復(fù)5 次，分別給以細(xì)胞培養(yǎng)液、前癃通膠囊 （藥液） 濃度為10、1、0.1 mg/mL，每孔加入100 μL 成細(xì)胞懸液，24 h 換液1 次。分別于培養(yǎng)24、48、72 h 后，用注射器吸掉孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMSO 混合液，室溫下振蕩5 min。

1.2.3 細(xì)胞增殖抑制率的檢測 全自動酶標(biāo)儀上于450 nm 波長下檢測，檢測24、48、72 h 點的各濃度細(xì)胞吸光值A(chǔ)，按照公式：細(xì)胞增殖抑制率%=1-(試驗孔A 值-細(xì)胞空白組A 值/藥物空白組A 值-細(xì)胞空白組A 值)×100%，計算出細(xì)胞增殖抑制率OD。

1.2.4 RT-PCR 擴(kuò)增法 （1）分組 將12 瓶長滿瓶底70%的細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成4 組，空白組：給予細(xì)胞完全培養(yǎng)液，前癃通膠囊高、中、低濃度組分別給予100、50、25 mg/mL，24 h 換液1 次每瓶加5 mL，連續(xù)給藥84 h。（2）檢測指標(biāo) 連續(xù)給藥84 h 后提取各樣本細(xì)胞的RNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀測RNA 的濃度和純度，分析TGF-β1 在BPH 中的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有資料均經(jīng)SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用“±s”表示，采用重復(fù)測量資料的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度前癃通膠囊對體外培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞增殖作用的影響

不同種濃度的前癃通膠囊都能抑制前列腺基質(zhì)細(xì)胞的增殖，且隨著時間的延長抑制作用增強(qiáng)，高濃度組在24、48、72 h 對前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，與中濃度組比，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中濃度組在24、48、72 h 對前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖起抑制作用，與低濃度組比，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度前癃通膠囊對體外培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞增殖作用的影響 （±s，n=5）

表1 不同濃度前癃通膠囊對體外培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞增殖作用的影響 （±s，n=5）

注：與低濃度組比較▲P＜0.01；與中濃度組比較*P＜0.01。

組 別高濃度組中濃度組低濃度組藥物劑量（g/mL）0.066 7 0.006 67 0.000 667 24 h 0.397 9±0.019▲*0.116 9±0.013▲0.074 2±0.009 48 h 0.619 2±0.039▲*0.129 3±0.008▲0.090 7±0.025 72 h 0.943 8±0.010▲*0.302 6±0.024▲0.115 8±0.010

2.2 不同濃度組藥液對TGF-β1mRNA 表達(dá)的影響

前列腺基質(zhì)細(xì)胞中的TGF-β1mRNA 表達(dá)隨著前癃通膠囊（藥液）濃度的增高呈現(xiàn)下降趨勢。TGFβ1mRNA 在高濃度組的表達(dá)最低，空白組的表達(dá)最高。高、中、低濃度組分別與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；高、中濃度組與低濃度組比較TGF-β1mRNA 的表達(dá)明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度前癃通干預(yù)下TGF-β1mRNA表達(dá)情況 （±s，n=5）

表2 不同濃度前癃通干預(yù)下TGF-β1mRNA表達(dá)情況 （±s，n=5）

注：與空白組比較▲P＜0.01；與低濃度組比較*P＜0.01。

組 別高濃度組中濃度組低濃度組空白組藥物劑量（g/mL）0.667 0.333 0.167—TGF-β1mRNA 0.3998±0.041▲*0.4785±0.035▲*0.5940±0.050▲0.7289±0.023

3 討論

TGF-β1 是調(diào)節(jié)前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的重要生長因子，是促進(jìn)BPH 的重要因素[7]。有研究表明，在前列腺組織內(nèi)TGF-β1 是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，由基質(zhì)細(xì)胞分泌，其受體存在于基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面，通過自分泌、旁分泌方式抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。TGF-β1mRNA 在增生前列腺組織中呈高水平表達(dá)，既可能是TGF-β1 刺激基質(zhì)細(xì)胞增殖導(dǎo)致前列腺增生；也有可能與前列腺組織中存在抗TGF-β1 細(xì)胞有關(guān)，該細(xì)胞的增殖導(dǎo)致了BPH 發(fā)生。研究結(jié)果提示，不同種濃度的前癃通膠囊都能抑制前列腺基質(zhì)細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加、時間的延長抑制作用增強(qiáng)；前列腺基質(zhì)細(xì)胞中的TGF-β1mRNA 表達(dá)隨著前癃通膠囊（藥液）濃度的增高呈現(xiàn)下降趨勢。進(jìn)一步說明了前癃通膠囊能通過不同程度降低前列腺基質(zhì)細(xì)胞TGF-β1 的表達(dá)，從而抑制前列腺基質(zhì)細(xì)胞的增殖，達(dá)到治療前列腺增生的效果。

前癃通膠囊[9-10]是導(dǎo)師賀菊喬教授經(jīng)過多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)出來的治療前列腺增生的經(jīng)驗方。由黃芪、田三七、王不留行、丹參、紅藤、穿山甲等藥組成。其中重用黃芪為君藥，益氣利水；穿山甲、田三七、丹參、紅藤，活血化瘀，軟堅散結(jié)為臣藥；王不留行利尿，活血化瘀為佐藥，以輔助君臣藥益氣利水，活血散瘀。諸藥合用，共奏益氣利水，活血散結(jié)之功?，F(xiàn)代藥理研究表明：黃芪有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，利尿、抗衰老，對包括bcl-2，bux 在內(nèi)的多種凋亡基因的表達(dá)具有調(diào)控作用[11]；王不留行可對老年前列腺增生者下丘腦-垂體-性腺軸功能減退有一定改善作用；穿山甲也對包括bcl-2，bux 在內(nèi)的多種凋亡基因的表達(dá)有調(diào)控作用。結(jié)果提示：前癃通膠囊明顯抑制了細(xì)胞生長因子TGF-β1 的表達(dá)，而且隨藥物濃度的增加，作用呈增強(qiáng)趨勢，說明益氣活血化瘀之前癃通膠囊抗BPH 的作用之一是通過抑制TGFβ1 過度表達(dá)而抑制增生的前列腺組織新生血管形成。前癃通膠囊治療BPH 的其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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