幾種天然產(chǎn)物對痛風性關節(jié)炎的影響初探

史 珅，賀 偉，胥紅梅，李 森，張葳芮，張澤生3，

1天獅集團有限公司博士后工作站;2天津市天獅生命科學與技術研究院，天津301700; 3天津科技大學博士后流動站;4天津科技大學食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室; 5天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457

幾種天然產(chǎn)物對痛風性關節(jié)炎的影響初探

史 珅1，2，3，4，5*，賀 偉4，5，胥紅梅4，5，李 森4，5，張葳芮1，2，張澤生3，4，5

1天獅集團有限公司博士后工作站;2天津市天獅生命科學與技術研究院，天津301700;3天津科技大學博士后流動站;4天津科技大學食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室;5天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457

為了探討幾種天然產(chǎn)物對痛風性關節(jié)炎模型大鼠的影響，通過對wistar大鼠踝關節(jié)注射尿酸鈉結(jié)晶，制作痛風性關節(jié)炎模型，并預先對實驗大鼠灌胃給藥褐藻糖膠、檸檬酸鉀和東哥阿里提取物，通過檢測踝關節(jié)腫脹度、步態(tài)積分及血清樣本中炎癥因子變化，研究其對痛風性關節(jié)炎的預防和緩解作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種活性物質(zhì)均可顯著降低痛風性關節(jié)炎實驗大鼠造模24 h踝關節(jié)腫脹度;東哥阿里提取物對實驗大鼠步態(tài)積分有降低作用;褐藻糖膠與東哥阿里提取物對髓過氧化物酶有顯著降低作用;東哥阿里提取物可以顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-8、NO和5-HT的血清濃度;因而推測，三種活性物質(zhì)均對尿酸鈉引起的痛風性關節(jié)炎有預防和緩解作用，其中東哥阿里提取物在減輕關節(jié)腫脹、緩解痛感及抑制炎癥發(fā)展方面有顯著作用。

尿酸;痛風性關節(jié)炎;褐藻糖膠;檸檬酸鉀;東哥阿里;大鼠

痛風是長期嘌呤代謝障礙，血尿酸增高引起組織損傷的綜合病癥。臨床表現(xiàn)以急性痛風性關節(jié)炎最為常見［1］，嚴重者可致關節(jié)活動障礙、畸形，腎尿酸結(jié)石及痛風性腎實質(zhì)病變等［2］。局部急性炎癥反應一般表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙五個方面。

尿酸為一種弱酸性物質(zhì)，溶解度很低，易呈針狀結(jié)晶析出沉積在溫度較低的遠側(cè)端肢體(如足趾)和酸度較高的組織(如運動后的肌肉、關節(jié)腔)。主要侵犯部位是關節(jié)的滑囊膜和關節(jié)軟骨、腎臟和皮下軟組織，因為關節(jié)軟骨、滑膜內(nèi)及關節(jié)周圍組織中血管較少［3］，運動后更易發(fā)生缺氧，加速糖分解而形成乳酸，于是pH降低，尿酸鈉沉積增多;此外基質(zhì)中含黏多糖酸及結(jié)締組織較豐富，因此尿酸鹽容易沉積。大量尿酸鹽結(jié)晶進入關節(jié)腔后，尿酸鹽結(jié)晶通過刺激炎性介質(zhì)的合成和釋放來誘發(fā)和維持強烈的炎性反應。

本文旨在研究褐藻糖膠、檸檬酸鉀及東哥阿里提取物對痛風性關節(jié)炎的預防和緩解作用。實驗采用Wistar雄性大鼠為實驗動物，對其灌胃上述三種活性物質(zhì)的生理鹽水溶液14 d，在給藥11 d時通過對大鼠右踝關節(jié)注射尿酸鈉溶液制作痛風性關節(jié)炎模型，在造模后24 h測定其踝關節(jié)腫脹程度，并在不同時間點觀察其步態(tài)，造模72 h后對大鼠股動脈取血，檢測血清中的炎癥因子及相關指標，以初步探討三種物質(zhì)對痛風性關節(jié)炎的影響和作用機制。

1 對象與方法

1.1 材料

生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)，紫外可見可變波長分光光度計(日本島津)，酶聯(lián)免疫生化試劑盒(RD，進口分裝)，MK-32酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

Wistar大白鼠，SPF級，雄性，體重300±20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXK(京)2006-0009。尿酸(Ameresco)，生理鹽水(天津市北方天醫(yī)化學試劑廠)。

褐藻糖膠(Fucoidan≥60%，上海森一生物科技有限公司)，檸檬酸鉀(≥99%，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責任公司)，東哥阿里提取物(100∶1，上海森一生物科技有限公司)，-20℃保存。

1.2 方法

飼養(yǎng)條件為屏障系統(tǒng)動物房，溫度22±2℃，相對濕度40%～60%，控制照明時間為14∶10 h。將健康大鼠隨機分成5組，每組8只，分別為空白對照組、模型對照組、褐藻糖膠組、檸檬酸鉀組和東哥阿里提取物組。褐藻糖膠、檸檬酸鉀和東哥阿里提取物給藥劑量為200 mg/kg·bw/d，空白組和模型組灌胃等量生理鹽水。

尿酸鈉結(jié)晶(monosodium urate，MSU)及尿酸鈉溶液的制備［4］:194 mL蒸餾水加6 mL 1M NaOH，煮沸，加1 g尿酸，用1N HCl調(diào)pH至7.2，攪拌冷卻，4℃冰箱保存24 h，去上清，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入70℃干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末，放入研缽內(nèi)研成細末，用孔徑250 μm的金屬篩過篩，制成尿酸鈉結(jié)晶。取1 g尿酸鈉加9 mL生理鹽水，l mL吐溫80，經(jīng)乳化機乳化，配制成10 mL 10%尿酸鈉溶液，高溫滅菌后備用。

動物模型的制作:第11 d灌胃給藥后，將50 μL濃度為10%的尿酸鈉溶液注入踝關節(jié)腔，空白組注射等體積滅菌生理鹽水，在踝關節(jié)同一固定位置用油性筆畫一位置作為標記用于測量踝關節(jié)的體積。

1.3 樣本的采集及測試方法

關節(jié)腫脹度的測定:根據(jù)排水容積法自制腫脹測量儀，測量大鼠造模踝關節(jié)同一部位的足容積，實驗時分別在造模0 h和24 h測量大鼠的踝關節(jié)體積，并計算造模24 h時大鼠踝關節(jié)腫脹率。

步態(tài)積分的評定:造模后24、48 h觀察各組大鼠的步態(tài)，進行評分并統(tǒng)計學分析，按Coderre等［5］介紹的步態(tài)分級標準進行評分，0分:正常行走，后肢正常壓力，兩側(cè)后肢平等負重;1分:輕微跛行，受試下肢略有彎曲，模型側(cè)后肢負重輕度減少，可完全觸地;2分:中度跛行，受試下肢剛觸及地面，后肢壓力中度減少，腿屈曲僅有部分肢體負重，接觸地;3分:重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走，后肢負重嚴重減少，少接觸地。

炎癥因子的測定:造模72 h后股動脈取血，收集血液，4℃、1500 g離心15 min分離血清，Elisa試劑盒測定相關炎癥因子水平。髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)的測定采用南京建成生化試劑盒。

統(tǒng)計學方法:實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，用單因素方差分析ANOVA(one-way analysis of variance)。分析實驗結(jié)果以均值士標準偏差(±s)表示，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗大鼠體重變化

圖4-1是實驗大鼠給藥階段的體重變化趨勢圖。由圖可見，各組實驗大鼠體重增長趨勢基本一致，給藥各實驗原料對實驗大鼠正常生長無顯著影響。

圖1 實驗大鼠體重變化趨勢Fig.1 Body weight trends of Experimental rats

2.2 實驗大鼠踝關節(jié)腫脹度和步態(tài)積分

造模24 h各組大鼠踝關節(jié)腫脹率的變化見圖2，模型組實驗大鼠踝關節(jié)腫脹度顯著(P＜0.01)高于空白對照組。褐藻糖膠、檸檬酸鉀和東哥阿里提取物在造模后24 h均顯著(P＜0.05)降低了實驗大鼠踝關節(jié)的腫脹度。

圖2 實驗大鼠造模后24 h踝關節(jié)腫脹率Fig.2 Rate of ankle swelling of rats in 24 hours after modeling

造模24、48 h后對大鼠的步態(tài)進行了觀測評價，各實驗原料對MSU致痛風關節(jié)炎大鼠步態(tài)的影響見圖3和圖4。與正常組大鼠相比，模型組大鼠注射MSU溶液后，活動減少，右后肢彎曲，行走時后肢抬起。由圖3可見，造模24 h時，褐藻糖膠組和東哥阿里提取物組實驗大鼠的步態(tài)積分均值較模型組降低;由圖4可見，造模48 h時，東哥阿里提取物組的步態(tài)積分均值較模型組降低。

2.3 實驗大鼠炎癥相關指標

圖5 實驗大鼠血清髓過氧化物酶活力Fig.5 Myeloperoxidase activity in serum of experimental rats

MPO是指征中性粒細胞活性的重要直接指標，圖5是痛風性關節(jié)炎實驗大鼠血清MPO的比較。其中，模型對照組大鼠血清MPO顯著(P＜0.05)高于空白對照組，可見該炎癥模型中，中性粒細胞活性增強，參與炎癥發(fā)生發(fā)展。在給藥組中，褐藻糖膠組和東哥阿里提取物組顯著(P＜0.05)低于模型對照組。

炎癥介質(zhì)中，本文主要關注了白細胞介素1β (Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素8(Interleukin-8，IL-8)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)和五羥色胺(5-Serotonin，5-HT)，表1是各因子在血清中水平的比較。與空白組比較，模型組血清IL-1β顯著(P＜0.01)高于空白對照組;東哥阿里提取物組顯著(P＜0.01)降低。模型組實驗大鼠血清IL-8水平顯著(P＜0.05)高于空白對照組;其中東哥阿里提取物組顯著(P＜0.05)低于模型對照，且與空白對照組無顯著差異。模型組的NO水平高于空白組，表明造模使大鼠體內(nèi)NO水平升高，從而加速炎癥反應。與模型組比較，褐藻糖膠組、檸檬酸鉀組和東哥阿里提取物組實驗大鼠血清NO水平顯著降低(P＜0.01)。模型組的5-HT高于空白組，表明以尿酸鈉結(jié)晶復制痛風性關節(jié)炎的方法造成實驗大鼠關節(jié)炎模型并引起痛感，與模型對照組比較，東哥阿里提取物組實驗大鼠血清5-HT水平顯著降低(P＜0.01)，推斷其對本模型中炎癥相關痛感有緩解作用。

表1 實驗大鼠血清炎癥細胞因子比較Table 1 Comparison of Inflammatory cytokines in Experimental tats serum

總之，褐藻糖膠、檸檬酸鉀和東哥阿里提取物三種活性物質(zhì)均能顯著(P＜0.01)降低NO的水平，東哥阿里提取物可以同時顯著(P＜0.01)降低IL-1β、IL-8、NO和5-HT的水平，對上述炎癥因子的生成有抑制作用。

炎癥的發(fā)生多表現(xiàn)為紅、熱、腫、痛和功能障礙的特征，本實驗中褐藻糖膠、檸檬酸鉀和東哥阿里提取物對關節(jié)注射尿酸鈉引起的關節(jié)腫脹有顯著(P＜0.01)抑制作用，推測三者對相關炎癥有緩解或抑制的效果;結(jié)合該推斷進行了髓過氧化物酶(MPO)、白介素、NO的檢測發(fā)現(xiàn)三者均可以降低血清MPO和NO的水平。MPO是中性粒細胞的功能標志和激活標志，是中性粒細胞所特有，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細胞(Neutrophilic polymorphonuclear leukocytes，PMN)的功能和活性狀態(tài)，即使在有強吞噬作用的巨噬細胞中也極少或完全沒有這種酶。在細胞化學上，一般將MPO作為中性粒細胞的標志。其功能為將氯氧化物和氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)榇温人猁}。在炎癥狀態(tài)下，它被釋入細胞外液，此酶參與含低密度脂蛋白的脂類氧化。PMN介導的炎癥是痛風性關節(jié)炎的核心所在，而增強的中性粒細胞-內(nèi)皮細胞黏連，是急性痛風產(chǎn)生的本質(zhì)。循環(huán)中的PMN正常情況下呈非活化狀態(tài)，在趨化因子和激活因子作用下可被激活，繼而侵入炎癥組織，引起組織損傷。激活因子通過與PMN細胞膜表面受體相結(jié)合，誘導PMN的呼吸爆發(fā)，激活的PMN在趨化因子作用下與血管內(nèi)皮細胞(Vascular endothelial cells，VEC)粘附并進入組織中，PMN粘附并穿越VEC向炎癥部位游走，是急性炎癥損傷過程的重要特征，PMN與VEC表面粘附因子的相互作用是其分子生物學基礎［6］。越來越多的證據(jù)表明［7-10］痛風性關節(jié)炎的核心是中性粒細胞介導的炎癥，在正常情況下組織中少見PMN，組織中PMN較循環(huán)中PMN重要，一般循環(huán)中PMN是非活化狀態(tài)，必須在趨化因子和激活因子作用下被激活，繼而侵入炎癥組織引起組織損傷并在組織損傷中起重要作用［11］。NO的合成和釋放可以促進炎癥反應，促進血管擴張，增強血管通透性，水腫，產(chǎn)生細胞毒性等，研究認為急慢性炎癥的發(fā)生均與體內(nèi)NO含量升高有關系。東哥阿里提取物組實驗大鼠MPO和NO血清中含量的降低，提示痛風性關節(jié)炎癥的紅腫表現(xiàn)及功能障礙的抑制機制與NO的調(diào)控和中性粒細胞的激活密切相關。

IL-1β是在PMN趨化、激活過程中起重要作用的炎癥細胞因子，是炎癥反應的重要調(diào)節(jié)劑［12］。IL-1β作為調(diào)節(jié)炎癥的始動因素，可增高微血管壁的通透性和炎性細胞趨化作用，激活炎性細胞，導致炎癥反應加重或發(fā)展，并可誘導IL-6、IL-8等二級前炎癥細胞因子。在痛風性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中，各個細胞因子非單獨作用，而是結(jié)合成網(wǎng)絡共同參與，互相影響。IL-1β主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，多存在于血及組織液中，可以誘導血管內(nèi)皮細胞表達細胞黏附因子，活化巨噬細胞及粒細胞，刺激單核-巨噬細胞等合成IL-1、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)等。IL-8生物學活性主要是趨化中性粒細胞、嗜酸(堿)性粒細胞、淋巴細胞等到炎癥局部引起炎癥或變態(tài)反應。另外，IL-8還能激活PMN、嗜堿性粒細胞，擴張血管，促進血管增生及粒細胞增生，是一個有效的PMN激活和趨化因子。因而，實驗中發(fā)現(xiàn)模型組與空白對照組的腫脹、肢體功能和MPO水平與上述白介素水平呈正相關性，而攝入東哥阿里提取物的實驗大鼠血清中IL-1β和IL-8水平降低也與肢體腫脹、功能障礙及中性粒細胞活性的減輕密切相關。

急性痛風性關節(jié)炎的主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛，尿酸鈉溶液引起的實驗性痛風性關節(jié)炎模型主要表現(xiàn)為痛覺高敏及出現(xiàn)疼痛反應伴隨肢體功能障礙。中樞5-HT和外周5-HT分屬兩個獨立系統(tǒng)，在外周5-HT屬致痛物質(zhì)，在中樞5-HT屬鎮(zhèn)痛物質(zhì)，實驗中主要測定了血液中的5-HT，屬于致痛物質(zhì)，此指標的升高指征實驗動物的痛感增強，反之則痛感降低。本實驗中檢測了實驗大鼠血清5-HT的水平，結(jié)果如表1所示。模型組的5-HT高于空白組，表明以尿酸鈉結(jié)晶復制痛風性關節(jié)炎的方法造成實驗大鼠關節(jié)炎模型并引起痛感，與模型對照組比較，東哥阿里提取物組實驗大鼠血清5-HT水平顯著降低(P＜0.01)，推斷其對本模型中炎癥相關痛感有緩解作用，結(jié)合步態(tài)積分進行分析，發(fā)現(xiàn)東哥阿里提取物可以降低尿酸鈉結(jié)晶造成的關節(jié)炎的痛感和對肢體正常功能的影響。

經(jīng)比較可知，在褐藻糖膠、檸檬酸鉀和東哥阿里提取物三種天然活性物質(zhì)中，東哥阿里提取物可以有效緩解和抑制尿酸鈉結(jié)晶引起的痛風性關節(jié)炎，對其臨床表現(xiàn)出的關節(jié)腫脹、患處疼痛和肢體功能障礙有較好的緩解作用，并且初步推斷其作用機制與通過抑制血清中炎癥因子IL-1β、IL-8、NO和5-HT的增高從而降低中性粒細胞的活化和向患處趨化的幾率密切相關。

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Effects of Several Natural Extracts on Gouty Arthritis in Rats

SHI Shen1，2，3，4，5*，HE Wei4，5，XU Hong-mei4，5，LI Sen4，5，ZHANG Wei-rui1，2，ZHANG Ze-sheng3，4，51Tiens Group Co.Ltd，Post-doctoral workstation;2Tianjin Tiens Academy of Life Science and Technology，Tianjin 301700，China;3Tianjin University of Science and Technology，Post-doctoral mobile station;4Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology;5Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China

Gouty arthritis is one of the most painful symptoms of gout patients.This research aimed to investigate the effect of several natural extracts on acute gouty arthritis in rats induced by monosodium urate(MSU)crystals.The animal model of acute gouty arthritis on wistar rats was made through injecting MSU in ankle joints.The rats were administrated orally with Fucoidan，Potassium Citrate and Tongkat Ali extracts.And the joint swelling，gait score and several inflammatory factors in serum were measured to discuss the prevention and relief effects in the inflammation-related limb swelling，pain，dysfunction of the natural extracts on acute gouty arthritis and investigated the mechanism preliminarily.As a result，the three kinds of natural extracts could significantly reduce the joint swelling after induction MSU in rats 24 h later.This showed that the three could inhibit the symptoms inflammation-related limb joint swelling.Tongkat Ali extracts could decrease the gait score.It means that the limb inflammation，pain and dysfunction had been reduced on the rats.Anti-inflammatory mechanisms of the three active substances were explored，by further testing of experimental rat serum biochemical indices.Fucoida and Tongkat Ali extracts could significantly reduce the level of Myeloperoxidase.It indicated that both the mitigation of the inflammatory response may be related to the activation of neutrophils.And Tongkat Ali extracts could significantly decrease the IL-1β，IL-8，NO and 5-HT of model rats.It showed that Tongkat Ali extracts had a certain inhibitory effect on the occurrence，development and other aspects of inflammation，while the symptoms of limb dysfunction was reduced by inhibiting the pain related inflammatory factor such as 5-HT.In conclusion，the three kinds of natural extracts can relieve the attack of acute gouty arthritis induced MSU in rats.And the Tongkat Ali extracts play an important role in reducing the joint swelling，relieving the pain and the inhibition of inflammation.

uric acid;urate arthritis;fucoidan;potassium citrate;Tongkat Ali;rat

1001-6880(2012)10-1362-06

2011-12-22 接受日期:2012-05-25

*通訊作者 E-mail:shishen1030@163.com

R284.2

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