老齡大鼠銅綠假單胞菌肺部感染模型建立及炎癥反應(yīng)研究

文婕 殷少軍

銅綠假單胞菌(PA)屬條件致病菌，好發(fā)于免疫力低下者，為院內(nèi)感染的重要病原菌之一[1-2]。老年特別是高齡患者抵抗力減弱，免疫功能低下，呼吸道防御能力削弱，多有基礎(chǔ)疾病和誘發(fā)因素，極易發(fā)生PA肺炎，且發(fā)病后缺乏特異性臨床表現(xiàn)，病死率高，臨床診治存在諸多困難。鑒于人類在體研究的局限性，建立合適的動物模型仍是進(jìn)行本病研究及篩選治療方案的重要手段。

盡管文獻(xiàn)中有關(guān)PA肺部感染的動物模型不少，但這些模型均是不同學(xué)者根據(jù)自己的研究領(lǐng)域和研究目的制作的，無論是動物種類、年齡、致病菌菌量還是接種方法等均不相同，很難比較、取舍。為了建立自己的急性老齡PA肺部感染動物模型，我們在借鑒前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。擬探討本建模方案的可行性，并通過觀察其病程和病理生理變化，探討該模型的應(yīng)用價(jià)值，以期為后續(xù)的深入研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性SD大鼠60只，鼠齡20～22月，體質(zhì)量700～900 g，由北京維通利華公司提供，統(tǒng)一編號并按照動物使用條例A-75-10-01進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

1.2 菌株來源 PA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)中心提供。35℃MH瓊脂平板培養(yǎng)24 h，采用麥?zhǔn)瞎苣繙y和分光光度儀比色法(波長550 nm，吸光度0.5)，用滅菌蒸餾水配成兩個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷舛?6×108cfu/ml)，國內(nèi)外PA誘導(dǎo)動物肺炎模型大多采用此細(xì)菌濃度[3-4]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及建模:將全部大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組30只，從中各取20只分別按氣管接種PA后2 h、6 h、9 h、12 h、24 h 分為5 個(gè)亞組，每亞組4 只。實(shí)驗(yàn)組大鼠采用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)行腹腔麻醉后，仰臥，固定于動物手術(shù)臺，抬高鼠板頭端，與操作臺面成30°角，減去頸部體毛，用0.5%絡(luò)合碘消毒術(shù)野，置于超凈工作臺，隨后于頸前正中縱向切開皮膚及皮下組織并向兩側(cè)牽開，逐層分離至暴露氣管，在直視下，用一枚頭皮針穿刺兩軟骨環(huán)之間，保持針頭與氣道方向一致，用1 ml無菌注射器取新鮮配置的PA菌液0.2 ml，自頭皮針管緩慢注入，接種后立即拔出針頭，豎立鼠板，保持大鼠直立體位30 s，并輕輕晃動頭部，以確保菌液均勻分布至兩側(cè)肺部隨后縫合處理頸部切口，置頭稍高位。對照組大鼠用等體積滅菌生理鹽水(NS)取代PA菌液，余處理同上。另取剩余大鼠(20只)同上建模，用于觀察氣管接種PA后生存率和生存時(shí)間。

1.3.2 標(biāo)本采取與處理:按分組于不同預(yù)定時(shí)間點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行標(biāo)本采集與處理:(1)心臟采血，麻醉固定同前，0.5%絡(luò)合碘消毒頸部和全胸，置于超凈工作臺，先解剖左側(cè)胸壁至肋間肌，見到心臟搏動后，用無菌注射器在心臟取血，置于10 ml真空采血管，4℃保存送檢，并處死大鼠;(2)解剖開胸，觀察雙肺肉眼改變，取右肺下葉部分組織送細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)，取右肺心葉10%福爾馬林固定，送病理學(xué)檢查。

1.4 病原學(xué)診斷 取約5 mm×5 mm×5 mm的肺組織塊無菌操作下以研磨器研磨成肺組織勻漿，并置于血瓊脂培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，24 h后觀察計(jì)數(shù)。肺炎模型的成功建立依賴于細(xì)菌學(xué)指標(biāo)(肺組織勻漿菌落計(jì)數(shù))和組織病理學(xué)檢查。建模標(biāo)準(zhǔn)，參照Pearson等[5]定義，稍作改動:急性期:(1)肺組織含菌量為 ＞105cfu/g，(2)病理組織學(xué)檢查，病理學(xué)改變包括:肺組織水腫、纖維蛋白滲出、中性粒細(xì)胞浸潤;慢性期:(1)肺組織含菌量為＞103cfu/g，(2)病理組織學(xué)檢查，病理學(xué)改變包括肺組織實(shí)變、纖維增生、淋巴細(xì)胞浸潤。

1.5 觀察指標(biāo) (1)一般情況:觀察各組大鼠接種后毛色、活動、呼吸、精神狀態(tài)、攝食等一般情況改變;(2)死亡率及死亡時(shí)間;(3)全血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù):采用CELL DYN3700全自動血細(xì)胞分析儀獸類檢測模式[6];(4)肺組織大體改變:開胸后，肉眼直視觀察;(5)肺組織病理學(xué)改變:以10%福爾馬林固定右肺心葉組織，常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件統(tǒng)計(jì)。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2組大鼠均于接種后半小時(shí)內(nèi)開始出現(xiàn)呼吸急促，搔鼻次數(shù)增多，偶有嗆咳。其中，對照組大鼠的表現(xiàn)于2 h內(nèi)明顯，2～6 h趨于平緩，6 h以后活動增多，呼吸道反應(yīng)逐漸減弱，毛發(fā)較整齊，至9～12 h接近術(shù)前水平，主動多次進(jìn)食、飲水，反應(yīng)較靈敏。實(shí)驗(yàn)組大鼠的表現(xiàn)進(jìn)行性加重，嗆咳明顯，搔鼻增多，呼吸道癥狀于12～16 h趨于平緩，但至24 h仍未恢復(fù)接種前水平，全過程均呈現(xiàn)毛發(fā)凌亂，無光澤，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動量及進(jìn)食量較對照組明顯減少。

2.2 死亡率比較 觀察7 d，對照組大鼠無一死亡，實(shí)驗(yàn)組大鼠4只死亡，分別死于接種后10 h、12 h、18 h、32 h。實(shí)驗(yàn)組死亡率(40%)明顯高于對照組(P＜0.05)。

2.3 肺組織細(xì)菌學(xué)結(jié)果 接種后2 h、6 h、9 h、12 h、24 h，對照組大鼠肺組織均未培養(yǎng)出PA，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織均培養(yǎng)出PA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。且隨時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織細(xì)菌負(fù)荷量呈下降趨勢，至24 h達(dá)最低，見表1。

2.4 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù) 接種后，對照組大鼠，外周血白細(xì)胞、多形核白細(xì)胞(PMN)未見明顯異常。實(shí)驗(yàn)組大鼠，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈先增后降趨勢，于12 h達(dá)高峰，隨后緩慢下降，至24 h仍稍高于對照組，見表2。

表1 2組大鼠氣管接種PA/NS前后肺組織細(xì)菌負(fù)荷動態(tài)變化(珋，×105 cfu/ml肺勻漿，n=30)

表1 2組大鼠氣管接種PA/NS前后肺組織細(xì)菌負(fù)荷動態(tài)變化(珋，×105 cfu/ml肺勻漿，n=30)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01

組別2 h 6 h 9 h 12 h 24 h實(shí)驗(yàn)組 2.39±0.39＊＊ 1.95±0.49＊＊ 1.31±0.17＊＊ 1.20±0.22＊＊ 0.58±0.23＊＊對照組00000

表2 2組大鼠氣管接種PA/NS前后外周血白細(xì)胞動態(tài)變化(珋，×109/L，n=30)

表2 2組大鼠氣管接種PA/NS前后外周血白細(xì)胞動態(tài)變化(珋，×109/L，n=30)

注:與對照組比較，*P＜0.05

項(xiàng)目 實(shí)驗(yàn)組 對照組2 h 白細(xì)胞總數(shù) 3.43±0.15*3.20±0.31 PMN 1.03±0.54 0.80±0.26 6 h 白細(xì)胞總數(shù) 4.65±2.56* 2.80±0.22 PMN 2.13±1.26 1.00±0.15 9 h 白細(xì)胞總數(shù) 6.48±1.46* 2.80±0.27 PMN 2.80±1.41* 0.70±0.11 12 h 白細(xì)胞總數(shù) 9.20±1.36* 2.50±0.15 PMN 5.30±1.74* 0.80±0.28 24 h 白細(xì)胞總數(shù) 3.67±1.32* 2.50±0.58 PMN 1.43±0.12*0.60±0.42

2.5 肺組織病理學(xué)檢查 接種前，2組大鼠肺組織肉眼觀及鏡下表現(xiàn)均未見異常，接種后:(1)標(biāo)本大體觀察:對照組大鼠雙側(cè)肺葉無明顯異常，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織(上葉及下葉為主)有不同程度水腫、出血、纖維化(斑塊)，9～24 h明顯。(2)鏡下觀察:對照組氣管接種NS后2～6 h，鏡下改變較局限，可見輕微水腫、出血，及少量炎癥細(xì)胞聚集，其他各階段均未見明顯異常;實(shí)驗(yàn)組大鼠氣管接種PA后，鏡下改變彌散，且隨時(shí)間進(jìn)展，PMN、單核巨噬細(xì)胞聚集增多，肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，水腫、出血多見，這些改變以6～24 h明顯，12～24 h達(dá)高峰(見圖1)。

圖1 肺組織病理學(xué)檢查(HE，×400)

3 討論

當(dāng)前細(xì)菌性肺炎占人類各類病原體肺炎的80%。PA屬條件致病菌，長期應(yīng)用激素、免疫抑制劑、腫瘤化療、放射治療等導(dǎo)致病人免疫功能低下，以及手術(shù)后及某些治療操作后(氣管切開，保留導(dǎo)尿管等)的病人易罹患本菌感染，故亦為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一[7-8]。老年特別是高齡患者，由于特殊生理原因，更易發(fā)生PA肺炎。因此建立老年P(guān)A肺部感染的動物模型，并探索其動物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)及觀測指標(biāo)，對臨床處理老年P(guān)A肺炎有重要價(jià)值。

為能模擬臨床免疫功能降低病人感染PA后的炎癥反應(yīng)及其特點(diǎn)，國內(nèi)學(xué)者李倬哲等[3]于2001年成功建立粒細(xì)胞減少大鼠PA肺炎動物模型。該模型，采用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺共同作用造成大鼠免疫功能下降、粒細(xì)胞減少。在此基礎(chǔ)上，適宜濃度的PA菌液經(jīng)氣管接種大鼠，以模擬臨床上常見的粒細(xì)胞缺少患者的肺部感染。此外，也有部分學(xué)者根據(jù)自己研究領(lǐng)域和研究目的不同，建立專門針對老齡動物的肺部細(xì)菌感染模型[9-10]，但鑒于研究目的不同，在實(shí)驗(yàn)動物選擇、年齡、接種劑量及接種方式上各不相同，各種方法之間，難以比較取舍。本實(shí)驗(yàn)在借鑒前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合整體實(shí)驗(yàn)研究目的，采用前述方法建立自己的急性老齡PA肺炎動物模型，在探討建模方法可行性的同時(shí)，以期為老齡PA肺炎動物模型的建立提供新的思路。

同時(shí)，考慮到本課題組主要研究方向，為能與青年動物模型間進(jìn)行良好比較，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上探索比較青年P(guān)A與老年P(guān)A肺炎患者在病理生理、生化等各方面的改變，為老齡PA肺炎的深入研究和探索更為合理有效的治療手段奠定基礎(chǔ)。因此，在接種劑量的選擇上，我們并未進(jìn)行劑量梯度實(shí)驗(yàn)，而是選用了目前國內(nèi)外誘導(dǎo)青年大鼠PA肺部感染模型的常用劑量，以探討該劑量誘導(dǎo)老齡動物模型的可行性。所以，本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于無法進(jìn)行不同建模劑量之間的橫向比較，以提供更好的選擇，關(guān)于該問題，我們會在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不斷完善。

另外，為使所建動物模型與臨床急性老齡PA肺炎的肺部炎癥發(fā)病過程，病理變化和細(xì)菌指標(biāo)更為接近，本實(shí)驗(yàn)在菌種選擇、無菌手術(shù)操作方面嚴(yán)格遵循相關(guān)原則。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照Pearson等[5]定義建模標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌學(xué)(肺組織勻漿菌落計(jì)數(shù))和組織病理學(xué)研究數(shù)據(jù)，以及相關(guān)輔助數(shù)據(jù)，表明:應(yīng)用經(jīng)氣管切開法接種PA標(biāo)準(zhǔn)菌液(ATCC27853，6×108cfu/ml，0.2 ml)可成功建立老年大鼠急性PA肺部感染模型，為臨床研究和控制老年急性PA肺部感染提供了基礎(chǔ)資料，具有重要參考價(jià)值。有關(guān)老齡大鼠PA肺部感染相關(guān)炎性因子表達(dá)及其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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