• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃曲霉菌株的分離、鑒定及產(chǎn)毒能力分析

    2012-11-23 03:45:36楊生瑞屈凌波孫長坡伍松陵
    中國糧油學(xué)報(bào) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:黃曲霉菌黃曲霉毒素

    楊生瑞 屈凌波 孫長坡 沈 晗 沈 瑾 伍松陵

    黃曲霉菌株的分離、鑒定及產(chǎn)毒能力分析

    楊生瑞1,2屈凌波1孫長坡2沈 晗2沈 瑾3伍松陵2

    (河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院1,鄭州 450001)
    (國家糧食局科學(xué)研究院2,北京 100037)
    (農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所3,北京 100126)

    對幾株從發(fā)霉糧食中分離出的黃曲霉菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)毒能力的HPLC測定。結(jié)果表明:試驗(yàn)分離菌株均為黃曲霉菌株且含有黃曲霉毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵基因aflR;黃曲霉菌株之間產(chǎn)毒能力差異巨大:黃曲霉菌株3.4408產(chǎn)毒量最高,黃曲霉菌株HDWS產(chǎn)毒量最低,黃曲霉菌株3.2572甚至不產(chǎn)生黃曲霉毒素;產(chǎn)生黃曲霉毒素菌株中部分黃曲霉菌株產(chǎn)生4種黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,黃曲霉菌株HDWH只產(chǎn)生黃曲霉毒素AFB1、AFB2。

    黃曲霉菌 黃曲霉毒素 aflR基因 高效液相色譜

    黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是所有真菌毒素中對環(huán)境污染最嚴(yán)重,對人畜危害最大且毒性最強(qiáng)的真菌次級代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素既有很強(qiáng)的急性毒性,導(dǎo)致肝臟壞死出血,使免疫系統(tǒng)受損,引起蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良癥并導(dǎo)致兒童發(fā)育受阻,也有明顯的慢性毒性引起肝癌,并具有致癌、致畸、致突變作用,對人、家畜和家禽的健康威脅極大,因此受到世界范圍的廣泛關(guān)注。研究表明有7種曲霉屬真菌可產(chǎn)黃曲霉毒素,分別為:Aspergillus flavus,A.parasitieus,A.nomius,A.Pseudot-amarii,A.bombycis,A.ochraceorosens及一種分離自西非的未定名分類元,最主要是由黃曲霉(Aspergillus flavus,A.flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus,A.paras-iticus)以玉米、花生和堅(jiān)果等農(nóng)作物及其制品為主產(chǎn)生的一類劇毒且致癌的代謝產(chǎn)物[1-3],主要包括:黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、黃曲霉毒素B2(Aflatoxin B2,AFB2)、黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)和黃曲霉毒素G2(Aflatoxin G2,AFG2),其中AFB1是毒性最強(qiáng)的致肝癌毒素。黃曲霉毒素不僅對人類健康危害極大,而且通過污染農(nóng)作物給國民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。鑒于其危害性很大,因此各國都制定了黃曲霉毒素的最高限量標(biāo)準(zhǔn)以保障消費(fèi)者的健康。中國規(guī)定了除玉米、花生及其制品外,絕大多數(shù)食品中的黃曲霉毒素AFB1的含量均不超過5μg/kg;歐盟規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品中(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)的最高限量為4μg/kg;美國規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)的最高限量為15μg/kg。

    黃曲霉毒素生物合成過程非常復(fù)雜,共涉及21步酶促反應(yīng)[4]。參與黃曲霉毒素合成的絕大多數(shù)基因聚集于一個(gè)特定的基因簇中,由基因簇中各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯而成[5]?;虼噩F(xiàn)象在次生代謝產(chǎn)物合成中比較常見[6]?;虺纱卮嬖谝彩屈S曲霉毒素合成途徑等次生代謝途徑的重要調(diào)控機(jī)制之一[7]。黃曲霉毒素生物合成途徑的調(diào)節(jié)基因aflR在黃曲霉毒素產(chǎn)生過程中具有十分重要的作用,aflR基因的表達(dá)產(chǎn)物AflR蛋白是一個(gè)鋅簇轉(zhuǎn)錄因子,能夠開關(guān)黃曲霉毒素途徑的其他基因轉(zhuǎn)錄,是黃曲霉毒素合成的關(guān)鍵蛋白[8],aflR基因的轉(zhuǎn)錄中斷可能抑制其他黃曲霉毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)[9]。由于AflR蛋白是黃曲霉毒素生物合成途徑中的主要正轉(zhuǎn)錄因子[8],大多數(shù)黃曲霉毒素合成相關(guān)基因受AflR蛋白的調(diào)節(jié)[10],除了estA基因外,黃曲霉毒素的生物合成途徑中相關(guān)酶基因的表達(dá)都受到AflR蛋白的正調(diào)節(jié)[11]。

    目前,針對黃曲霉毒素的檢測方法主要有高效薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜(HPLC)法、熒光計(jì)和酶聯(lián)免疫(ELISA)法、樣品前處理方法中也多采用免疫親合柱(IAC)或多功能固相萃取柱進(jìn)行純化處理。試驗(yàn)研究用IAC純化、在線光化學(xué)衍生化、HPLC法配熒光檢測器測定篩選獲得的黃曲霉菌株是否產(chǎn)生黃曲霉毒素[12],以期為解析黃曲霉菌污染的特點(diǎn)和開發(fā)黃曲霉毒素防控技術(shù)提供幫助。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    所用菌株為Aspergillus flavus 3.4408和3.2572,購自中國微生物菌種保藏中心;Asperg-illus flavus HDWS、HDWH和ASAG3三株黃曲霉菌為本試驗(yàn)篩選獲得;大腸桿菌JM109,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所惠贈。

    1.2 儀器和試劑

    DNA聚合酶(KOD-Plus):TOYOBO公司;DNA Marker DL2000,TaKaRa公司;DNA連接酶(PMD 19-T Vector):TaKaRa公司;快速定性濾紙;免疫親合柱;64R型冷凍離心機(jī):BECKMAN公司;N.Y.10018,U.S.A光化學(xué)衍生器:AURA公司;1100型高效液相色譜儀配熒光檢測器:Agilent公司;ABI PCR擴(kuò)增儀:美國Applied Biosystems公司:高速震蕩器;氮?dú)獯蹈蓛x;六位泵流操作架。

    所用水為雙蒸水和超純水;甲醇、乙腈:色譜純,迪馬公司;甲醇、二氯甲烷、正己烷、氯化鈉:分析純,北京化工廠;黃曲霉毒素B1、B1、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液:純度>99%,Sigma公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌株分離方法

    稱取黃曲霉毒素超標(biāo)的發(fā)霉玉米和小麥各10 g,用100 mL無菌水?dāng)噭蜃鳛樵?,然后吸? mL依次稀釋為10-1至10-88個(gè)濃度梯度。分別取各濃度的稀釋液200μL涂布于察氏培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)6 d。劃線分離得到單菌落,以黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株3.4408對照,在熒光顯微鏡下觀察進(jìn)行孢子的形態(tài)學(xué)鑒定。

    1.3.2 產(chǎn)毒關(guān)鍵基因aflR的PCR鑒定

    提取曲霉菌基因組DNA,根據(jù)aflR基因序列設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物。上游引物為aflR-5'-AACCGCATCCACAATCTCAT-3',下游引物為aflR-5'-AGTGCAGTTCGCTCA GAACA-3'[13]。

    以菌株基因組DNA為模版,采用40μLPCR體系,依次加入:4μL 10×Buffer(不含Mg2+),2μL(25 mmol/L)MgSO4,4μL(2 mmol/L)dNTPs混合物,上、下游引物各1μL,1μL的DNA模板和1μL KOD-plus-聚合酶,最后加入26μL無菌去離子水。PCR擴(kuò)增條件如下:94℃預(yù)變性5 min,進(jìn)入循環(huán)程序:94℃變性1 min,52℃退火1 min,68℃延伸1 min,32個(gè)循環(huán),再68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后插入PMD 19-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序鑒定。測序結(jié)果在Gene Bank中做Blast比對分析。

    1.3.3 黃曲霉菌的株固體發(fā)酵培養(yǎng)

    將黃曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基平板上,28℃恒溫培養(yǎng)5 d[14]。取平板上的單菌落接種于察氏斜面培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)5~6 d。待斜面上布滿黃綠色菌絲,并菌絲上略生孢子時(shí),用無菌水制成孢子懸液,接種于裝有滅菌大豆培養(yǎng)基的1 000 mL的三角瓶中,再加入無菌蒸餾水混勻,固液比為3:1,置28℃恒溫培養(yǎng)21 d。

    1.3.4 黃曲霉毒素的萃取[15-16]

    取發(fā)酵產(chǎn)物20 g,加入5 g氯化鈉、100 mL甲醇 -水(55+45)的溶液,于振蕩器上振蕩30 min,用快速定性濾紙過濾,收集濾液。取50 mL濾液,于250 mL分液漏斗中,向分液漏斗中加入50 mL的正己烷,手動提取約1 min,靜置分層,如有乳化,滴加少許甲醇促使分層,甲醇-水層轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗,在分液漏斗中加入50 mL的二氯甲烷,萃取分離。將二氯甲烷層收集到150 mL茄形瓶中,再重復(fù)萃取2次,收集到同一茄形瓶中,氮?dú)獯蹈芍链蠹s3 mL液體。將3 mL液體用多功能凈化柱凈化待測。

    1.3.5 黃曲霉毒素檢測的色譜條件

    黃曲霉毒分析柱使用Venusil XBP反相C18柱,粒徑:5μm規(guī)格:4.6×250 mm;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:25℃;流動相:甲醇/水(50∶50,體積比);流速:1 mL/mim;熒光檢測器:Ex=360 nm,Em=440 nm;采用AURA光化學(xué)衍生池柱后衍生。

    1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

    將1μg/mL的AFG1、AFB1和0.3μg/mL的AFG2、AFB2的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋,配成AFG1、AFB1濃度為2、5、10、15、20μg/L;AFG2、AFB2濃度為0.6、1.5、3、4.5、6μg/L的黃曲霉毒素工作溶液。在1.2.5的色譜條件下進(jìn)樣檢測,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 黃曲霉菌株形態(tài)學(xué)鑒定

    挑取黃曲霉菌株A.Flavus3.4408、A.Flavus HD-WS、A.Flavus HDWH、A.Flavus ASAG3孢子制片,在40倍熒光顯微鏡下觀察黃曲霉菌株孢子形態(tài),結(jié)果如圖1所示。

    圖1 熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定圖

    如圖1所示,在40倍熒光顯微鏡下觀察篩選菌株孢子形態(tài),同時(shí)與黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株3.4408對照,初步鑒定本試驗(yàn)篩選獲得菌株為黃曲霉菌株。

    2.2 曲霉菌株aflR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

    利用aflR基因的特異擴(kuò)增引物通過PCR擴(kuò)增,核酸電泳如圖2所示,分析發(fā)現(xiàn)分離菌株得到的aflR基因擴(kuò)增片段與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增獲得的aflR基因片段大小一致,測序結(jié)果在Gene Bank中做Blast比對分析表明aflR基因相似度達(dá)到99%以上,因此可確定所篩菌株含有黃曲霉毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵基因aflR。

    圖2 曲霉菌株aflR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    在所選用色譜條件下,黃曲霉毒素得到良好的基線分離,4種毒素在15 min內(nèi)出峰,先后順序?yàn)锳FG2、AFG1、AFB2、AFB1,圖3為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

    圖3 黃曲霉毒素AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

    分別量取已梯度稀釋好的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,其中AFG1、AFB1質(zhì)量濃度為2、5、10、15、20μg/L;AFG2、AFB2濃度為6、4.5、3、1.5、0.6 μg/L的黃曲霉毒素工作溶液,在上述條件下進(jìn)樣檢測,以黃曲霉毒素的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo),繪制AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得線性回歸方程如表1所示。由表1可知黃曲霉毒素在2~20μg/L和0.6~6μg/L的濃度范圍內(nèi)線性良好。

    表1 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程

    2.4 黃曲霉菌株產(chǎn)毒量測定

    在本試驗(yàn)條件下,黃曲霉毒素混標(biāo)出峰順序?yàn)锳FG2、AFG1、AFB2、AFB1,黃曲霉毒素各組分均可有效分離,各黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素液相色譜圖見圖4。

    圖4 黃曲霉菌各菌株液相測定色譜圖

    從圖4中可以看出,黃曲霉毒素各組分均可有效分離,4種毒素在15 min內(nèi)出峰。在檢測過程中黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株3.4408的毒素提取液由于產(chǎn)毒量太大做了500倍稀釋,其他菌株提取液均做50倍稀釋。本試驗(yàn)中黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株A.Flavus3.4408和篩選的黃曲霉菌A.Flavus ASAG3和A.Flavus HDWS都有AFG2、AFG1、AFB2、AFB1檢出,黃 曲 霉 菌A.Flavus HDWH檢出只產(chǎn)AFB2、AFB1,而A.Flavus 3.2572沒有黃曲霉毒素檢出。通過HPLC檢測結(jié)果,計(jì)算黃曲霉菌株產(chǎn)毒情況如表2。

    表2 黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素含量/μg/kg

    黃曲霉菌株在每克大豆培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃曲霉毒素的含量差異很大,由表2可知,黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌A.Flavus3.4408產(chǎn)毒量最高AFG2為536.23μg/kg、AFG1為3 217.5μg/kg、AFB2為279.42μg/kg、AFB1為1 031.28μg/kg,平均達(dá)到每千克培養(yǎng)基產(chǎn)毒量能達(dá)到毫克以上;分離得到的黃曲霉菌株A.Flavus ASAG3產(chǎn)生黃曲霉毒素AFG2為56.3μg/kg、AFG1為613.48μg/kg、AFB2為37.88μg/kg、AFB1為175.77μg/kg;黃曲霉菌株A.Flavus HDWS產(chǎn)生黃曲霉毒素含量較低AFG2為21.37μg/kg、AFG1為167.62μg/kg、AFB2為16.2μg/kg、AFB1為68.66 μg/kg;而黃曲霉菌菌株A.Flavus3.2572則沒有黃曲霉毒素產(chǎn)生。

    3 討論與結(jié)論

    研究對發(fā)霉糧食中分離得到的三株菌株和中國微生物菌種保藏中心購買得到的兩株黃曲霉菌(3.4408、3.2572)通過形態(tài)學(xué)鑒定,初步確定分離菌株為黃曲霉菌。由于PCR技術(shù)具有靈敏、特異、快速等特點(diǎn),本研究采用PCR技術(shù)對分離菌株做進(jìn)一步鑒定。aflR基因在黃曲霉毒素產(chǎn)生過程中具有十分重要的作用,aflR基因的轉(zhuǎn)錄中斷可能抑制其他黃曲霉毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)[9]。本試驗(yàn)所用引物與Somashekar等[13]相同,通過設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增檢測,發(fā)現(xiàn)所分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株中均含有黃曲霉毒素產(chǎn)生關(guān)鍵基因aflR。將測序結(jié)果在Gene Bank中進(jìn)行Blast比對分析表明:試驗(yàn)分離菌株和菌株與FN3981 57.1黃曲霉ITEM 8094和AY510455.1黃曲霉菌株AF36的aflR基因相似度達(dá)到99%以上,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定最終確定所分離菌株為黃曲霉菌株。

    HPLC檢測不同黃曲霉菌株的產(chǎn)生黃曲霉毒素毒能力差異時(shí),由于在線光化學(xué)衍生裝置不需要在流動相中加任何試劑,待測樣品在流經(jīng)光化學(xué)衍生器中被紫外燈管照射的網(wǎng)狀通路時(shí),解決了AFB1和AFG1在檢測中熒光強(qiáng)度較低的問題,AFB1和AFG1的熒光強(qiáng)度被大大提高,所以本實(shí)驗(yàn)HPLC檢測采用柱后衍生光化學(xué)衍生器。

    本研究下一步將繼續(xù)探索影響黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素的原因和機(jī)理。尋求快速鑒別曲霉菌株是否產(chǎn)毒的方法,為糧油食品中潛在產(chǎn)生黃曲霉毒素的菌株鑒別和食品發(fā)酵工業(yè)菌株的選育和安全應(yīng)用提供實(shí)用快速的鑒別技術(shù)。

    [1]Eaton D L,Gallagher E P.Mechanisms of Alfatoxin carchinogenesie[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1994,34:135-172

    [2]Chang P K,Yu J,Bhantagar D,et al.The Carboxy -Terminal Portion of the Aflatoxin Pathway Regulatory Protein AFLR of Aspergillus parasiticus Activates GAL1::lacZ Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae[J].Applied and Eevironmental Microbiology,1999,65(6):2508-2512

    [3]Abbas H K,Weaver MA,Zablotowicz RM,et al.Relationships between aflatoxin production and sclerotia formation among isolates of Aspergillus section Flavi from the Mississippi Delta[J].European Journalof Plant Patholilogy,2005,112:283 -287

    [4]Bhatnagar D,Ehrlich K C,Cleveland TE,et al.Molecular genetic analysis and regulation of aflatoxin biosynthesis[J].Appl Microbiol Biotechonl,2003,61:83-93

    [5]Yu J,Chang P K,Bhatnagar D,et al.Genes encoding cytochrome P450 and monooxygenase enzymes define one end of the aflatoxin pathway gene cluster in Aspergillus parasiticus[J].Appl Microbiol Biotechnol,2000,53(5):583-590

    [6]Keller NP,Hohn TM.Metabolic pathway gene clusters in filamentous fungi[J].Fungal Genetics and Biology,1997,21:17-29

    [7]Georgianna D R,Payne G A.Genetic regulation of aflatoxin biosynthesis:From gene to genome[J].Fungal Genetics and Biology,2009,46:113-115

    [8]Ehrlich K C,Montalbano BG,Bhatnagar D,et al.Alteration of different domains in AflR affects aflatoxin pathway metabolism in Aspergillus parasiticus transformants[J].Fungal Genetics and Biology,1998,23:279-287

    [9]Cary J W,Ehrlich K C,Wright M,et al.Generation of aflR disruption mutants of Aspergillus parasiticus[J].Appl Microbiol Biotechnol,2000,53:680-684

    [10]Ehrlich K C,Montalbano B G,Cotty P.J.Sequence comparison of aflR from different Aspergillus spe cies provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production[J].Fungal Genetics and Biology,2003,38:63-74

    [11]Yu J,Chang P K,Cleveland D B E.Cloning and functional expression of an esterase gene in Aspergillus Parasiticus[J].Mycopathologia,2002,156:227-234

    [12]張春艷,周孝治,陳菊芳,等.光化學(xué)衍生-高效液相色譜法測定黃曲霉毒素含量[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,36(5):570-571

    [13]Somashekar D,Rati E R,Chandrashekar A.PCR-restriction fragment length analysis of aflR gene for differentiation and detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus inmaize[J].International Journal of Food Microbiology,2004,93(1):101-107

    [14]Brackett R E.Strategies for dealing with aflatoxins in peanuts[M].Yam T C,Tan C.Trends in Food Product Development.Singapore:Singapore Institute of Food Science and Technology,1989:83-91

    [15]程樹峰,唐芳,伍松陵.碘柱前衍生-高效液相色譜法快速測定糧食中黃曲霉毒素[J].糧油食品科技,2008,16(6):40-55

    [16]高秀芬,計(jì)融,李燕俊,等.高效液相色譜法測定玉米中的黃曲霉毒素[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2007,19(2):105-108.

    Isolation and Identification of Aspergillus Flavus Strains and Analysis of Toxin-Producing Ability

    Yang Shengrui1,2Qu Lingbo1Sun Changpo2Shen Han2Shen Jin3Wu Songling2
    (College of Bioengineering,Henan University of Technology1,Zhengzhou 450001)
    (Academy of State Administration of Grain2,Beijing 100037)
    (Institute of Agricultural By - p roducts Processing,Chinese Academy of Agricultural Engineering3,Beijing 100026)

    Several Aspergillus flavus strains were isolated from moldy grain,then were identified by spore morphological and Molecular Biological Identification.The toxin-producing ability of strains were detected and analyzed by HPLC after fermentation.The results showed that experimental isolated strain were Aspergillus flavus and contains toxigenic key gene of afl;the toxin-producing ability was very different between these Aspergillus flavus strains.Aspergillus flavus 3.4408 produce the hightest aflatoxin while Aspergillus flavus HDWS only produces a little.Even more,Aspergillus flavus 3.2572 could not produce aflatoxin under the same condition;Among aflatoxin-producing strains,some of the strains produce aflatoxin AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,Aspergillus flavus HDWH only produces aflatoxin AFB1,AFB2.

    Aspergillus flavus,aflatoxin,aflR gene,HPLC

    Q93-31

    A

    1003-0174(2012)06-0110-06

    時(shí)間:2012-04-27 08:44

    網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20120427.0844.001.html

    國家科技支撐計(jì)劃(2009BADA0B05),公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003077)

    2011-12-26

    楊生瑞,男,1987年出生,碩士,微生物學(xué)

    伍松陵,女,1967年出生,副研究員,生化工程

    猜你喜歡
    黃曲霉菌黃曲霉毒素
    What Makes You Tired
    IAC-HPLC-ESI-MS/MS法測定不同產(chǎn)地柏子仁中4種黃曲霉毒素
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:38:40
    雞黃曲霉毒素中毒的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室診斷與防治
    北方根結(jié)線蟲對花生黃曲霉菌及其毒素污染的影響
    一類具有毒素的非均勻chemostat模型正解的存在性和唯一性
    PEG介導(dǎo)黃曲霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系*
    不產(chǎn)毒黃曲霉菌株的篩選鑒定及分子機(jī)理研究
    10種中藥水提物對黃曲霉菌體外生長特性的影響
    毒蘑菇中毒素的研究進(jìn)展
    嚴(yán)苛標(biāo)準(zhǔn)方能清洗校園“毒素”
    在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲国产欧美网| 免费在线观看影片大全网站 | 欧美激情高清一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 久久99热这里只频精品6学生| 下体分泌物呈黄色| 亚洲第一av免费看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲综合色网址| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产高清视频在线播放一区 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 91九色精品人成在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人手机av| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲中文字幕日韩| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久久久久久久久久久大奶| 国产男女内射视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品国产av在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 午夜av观看不卡| 成人影院久久| 在线观看www视频免费| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品成人在线| av在线播放精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 高清视频免费观看一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 黄频高清免费视频| 操美女的视频在线观看| 国产又爽黄色视频| 免费观看人在逋| 日韩制服骚丝袜av| 大片免费播放器 马上看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久九九热精品免费| 国产精品一区二区在线不卡| 免费看av在线观看网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 国产在视频线精品| av欧美777| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产视频首页在线观看| 妹子高潮喷水视频| 女人久久www免费人成看片| 最黄视频免费看| 脱女人内裤的视频| av线在线观看网站| 男女之事视频高清在线观看 | 久久久久久人人人人人| 午夜福利在线免费观看网站| 少妇的丰满在线观看| av电影中文网址| av天堂在线播放| 色94色欧美一区二区| 操出白浆在线播放| 精品久久久精品久久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久久久久久久久大奶| 色视频在线一区二区三区| 999精品在线视频| 亚洲久久久国产精品| 中文欧美无线码| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美日韩黄片免| 男的添女的下面高潮视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品人妻久久久影院| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 韩国高清视频一区二区三区| av有码第一页| 亚洲成国产人片在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 一个人免费看片子| 精品免费久久久久久久清纯 | 18禁国产床啪视频网站| 青草久久国产| 久久精品久久精品一区二区三区| 日本91视频免费播放| 久久人妻熟女aⅴ| av网站在线播放免费| 老司机影院成人| 成年动漫av网址| av网站免费在线观看视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 另类精品久久| 女人久久www免费人成看片| 极品人妻少妇av视频| 精品久久久精品久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久久久久久精品精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产男女超爽视频在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 麻豆乱淫一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 成人亚洲精品一区在线观看| 极品人妻少妇av视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 99国产综合亚洲精品| 婷婷色综合大香蕉| 我要看黄色一级片免费的| 国产日韩欧美在线精品| 两性夫妻黄色片| 国产av国产精品国产| 国产爽快片一区二区三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 伦理电影免费视频| 亚洲伊人色综图| 免费观看人在逋| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美成人午夜精品| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲免费av在线视频| 在线 av 中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 十分钟在线观看高清视频www| 成年人午夜在线观看视频| 免费看不卡的av| 亚洲熟女精品中文字幕| 在现免费观看毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一区在线观看完整版| 大片免费播放器 马上看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美精品一区二区免费开放| 一本久久精品| 国产av一区二区精品久久| 91国产中文字幕| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 十八禁高潮呻吟视频| 国产成人精品久久二区二区91| 黑人猛操日本美女一级片| 妹子高潮喷水视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 男女边吃奶边做爰视频| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 丰满少妇做爰视频| kizo精华| 国产97色在线日韩免费| 婷婷色av中文字幕| 久久中文字幕一级| 在线观看国产h片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产黄频视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 91成人精品电影| 日韩av在线免费看完整版不卡| 免费在线观看日本一区| 国产xxxxx性猛交| 交换朋友夫妻互换小说| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 好男人视频免费观看在线| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜福利视频精品| 日韩电影二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 9191精品国产免费久久| 日韩视频在线欧美| 日本午夜av视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 在现免费观看毛片| 女人久久www免费人成看片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲三区欧美一区| 国产伦人伦偷精品视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 十八禁人妻一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产色视频综合| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产精品国产av在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99国产综合亚洲精品| 成人影院久久| 少妇精品久久久久久久| 亚洲人成电影免费在线| 9热在线视频观看99| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 国产免费现黄频在线看| 青青草视频在线视频观看| 精品亚洲成国产av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 免费观看人在逋| 黄片播放在线免费| 欧美黑人精品巨大| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 97精品久久久久久久久久精品| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 精品高清国产在线一区| 久久亚洲国产成人精品v| 操美女的视频在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 视频在线观看一区二区三区| av不卡在线播放| 在线精品无人区一区二区三| 激情五月婷婷亚洲| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 麻豆国产av国片精品| 五月天丁香电影| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 在线精品无人区一区二区三| 男女高潮啪啪啪动态图| av在线app专区| 亚洲人成电影观看| 欧美性长视频在线观看| 色94色欧美一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲欧洲国产日韩| 久久国产精品影院| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品久久蜜臀av无| av线在线观看网站| 在线观看免费午夜福利视频| 一级黄片播放器| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲国产看品久久| e午夜精品久久久久久久| 在线观看www视频免费| 国产成人精品久久二区二区91| 国产免费视频播放在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费观看a级毛片全部| 精品福利观看| 国产福利在线免费观看视频| 咕卡用的链子| 看十八女毛片水多多多| 校园人妻丝袜中文字幕| 日韩欧美一区视频在线观看| 操美女的视频在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 1024视频免费在线观看| 老司机影院成人| 亚洲av电影在线进入| 欧美大码av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 操出白浆在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品自拍成人| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日本a在线网址| 日日爽夜夜爽网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲专区中文字幕在线| 99香蕉大伊视频| 午夜激情av网站| 色网站视频免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产成人系列免费观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 蜜桃国产av成人99| 一区二区三区精品91| 2021少妇久久久久久久久久久| 视频区欧美日本亚洲| 青青草视频在线视频观看| 欧美黑人精品巨大| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本vs欧美在线观看视频| 老司机靠b影院| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 免费高清在线观看视频在线观看| 丝袜脚勾引网站| 久久中文字幕一级| 人妻人人澡人人爽人人| 免费高清在线观看日韩| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产精品999| 国产亚洲欧美精品永久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 大香蕉久久成人网| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩一本色道免费dvd| av不卡在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 咕卡用的链子| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产国语露脸激情在线看| 性色av一级| 亚洲精品自拍成人| a 毛片基地| 欧美xxⅹ黑人| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲七黄色美女视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产99久久九九免费精品| 免费在线观看完整版高清| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品一区二区三卡| 国产成人精品无人区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产高清不卡午夜福利| 99久久综合免费| 九草在线视频观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 一二三四社区在线视频社区8| 两个人看的免费小视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜激情久久久久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产在线观看jvid| av网站在线播放免费| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产一区二区在线观看av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 69精品国产乱码久久久| 国产高清视频在线播放一区 | 国产99久久九九免费精品| 国产精品二区激情视频| 久久综合国产亚洲精品| 国产在线视频一区二区| 日本av手机在线免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 搡老乐熟女国产| 国产av一区二区精品久久| √禁漫天堂资源中文www| 一区福利在线观看| 高清av免费在线| 国产免费又黄又爽又色| 夫妻午夜视频| kizo精华| 中国国产av一级| 黄片小视频在线播放| 久久影院123| 国产不卡av网站在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 女人久久www免费人成看片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日本黄色日本黄色录像| av在线播放精品| www.av在线官网国产| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美激情 高清一区二区三区| 男女国产视频网站| 高清视频免费观看一区二区| 高清不卡的av网站| 国产免费现黄频在线看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲欧美精品自产自拍| 九色亚洲精品在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品 国内视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 超色免费av| 妹子高潮喷水视频| 又大又黄又爽视频免费| 国产野战对白在线观看| av网站在线播放免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黑人猛操日本美女一级片| 国产欧美日韩一区二区三 | 精品少妇内射三级| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品久久久久久精品电影小说| 男女下面插进去视频免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 久久99精品国语久久久| 老汉色∧v一级毛片| 制服诱惑二区| 老熟女久久久| 国产成人欧美在线观看 | www.熟女人妻精品国产| 宅男免费午夜| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲成色77777| 一本综合久久免费| 满18在线观看网站| 国产视频一区二区在线看| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 桃花免费在线播放| 青春草视频在线免费观看| 一级毛片电影观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产色视频综合| 中文字幕制服av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 多毛熟女@视频| kizo精华| 国产免费视频播放在线视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 五月天丁香电影| 麻豆av在线久日| 亚洲精品在线美女| 亚洲国产av新网站| 日韩电影二区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 嫩草影视91久久| 成人国语在线视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 黑人欧美特级aaaaaa片| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久久久人人人人人| 各种免费的搞黄视频| 美女中出高潮动态图| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲情色 制服丝袜| 国产亚洲欧美在线一区二区| av电影中文网址| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲五月色婷婷综合| 国产一区二区三区av在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 两人在一起打扑克的视频| 久久狼人影院| 午夜免费鲁丝| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 2021少妇久久久久久久久久久| 伊人亚洲综合成人网| 欧美成人午夜精品| 午夜老司机福利片| 免费少妇av软件| 搡老乐熟女国产| 国产一区二区激情短视频 | 国产xxxxx性猛交| 欧美大码av| av有码第一页| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| av天堂在线播放| 国产精品免费大片| 91精品三级在线观看| 久久精品国产综合久久久| 欧美在线一区亚洲| 黄色 视频免费看| 亚洲免费av在线视频| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费观看av网站的网址| 国产日韩欧美视频二区| 国产一区二区在线观看av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 91老司机精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美97在线视频| 丰满迷人的少妇在线观看| videosex国产| 精品福利观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 日韩视频在线欧美| 精品少妇久久久久久888优播| 大陆偷拍与自拍| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久久久久久免费视频了| 久久中文字幕一级| 亚洲成人免费电影在线观看 | av欧美777| 日本av手机在线免费观看| 波野结衣二区三区在线| 老司机亚洲免费影院| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品国产av蜜桃| 色综合欧美亚洲国产小说| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 最近手机中文字幕大全| 国产黄频视频在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 天堂俺去俺来也www色官网| 99久久精品国产亚洲精品| 精品人妻在线不人妻| 中文字幕av电影在线播放| 在线看a的网站| 婷婷成人精品国产| 婷婷丁香在线五月| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男人操女人黄网站| 欧美97在线视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久99一区二区三区| 黄色 视频免费看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 人妻一区二区av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 成人国产一区最新在线观看 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 超碰成人久久| 国产精品偷伦视频观看了| av线在线观看网站| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美性长视频在线观看| 日本色播在线视频| 亚洲第一av免费看| 一区二区三区四区激情视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丝袜在线中文字幕| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 久9热在线精品视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲av日韩在线播放| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一级毛片 在线播放| 亚洲男人天堂网一区| av不卡在线播放| 婷婷色综合大香蕉| 久热这里只有精品99| 国产成人a∨麻豆精品| cao死你这个sao货| 韩国精品一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲中文字幕日韩| 日韩中文字幕视频在线看片| 黄色视频不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲美女黄色视频免费看| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产1区2区3区精品| 久久精品成人免费网站| av在线app专区| 天堂8中文在线网| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲国产欧美在线一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美日韩av久久| 成年人黄色毛片网站| 久久狼人影院| 国产成人av激情在线播放| 亚洲成色77777| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品久久久人人做人人爽| 看免费av毛片| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | av福利片在线| 热99久久久久精品小说推荐| 一本综合久久免费| 69精品国产乱码久久久| 国产av一区二区精品久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 男人操女人黄网站| 两个人免费观看高清视频| 人妻人人澡人人爽人人| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 国产在视频线精品| 精品熟女少妇八av免费久了| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品国产av成人精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美变态另类bdsm刘玥| 人妻人人澡人人爽人人| 99香蕉大伊视频| 国产一卡二卡三卡精品| 99国产精品一区二区三区| 国产成人av教育| 国产91精品成人一区二区三区 | 99九九在线精品视频| 波多野结衣一区麻豆| av视频免费观看在线观看|