雙波長分光光度法測定木薯塊根淀粉含量的動態(tài)變化

黃惠芳 羅燕春 田益農(nóng) 付海天 蘇文潘 彭靖茹 黎 萍 黃 強(qiáng) 侯學(xué)文

雙波長分光光度法測定木薯塊根淀粉含量的動態(tài)變化

黃惠芳1，2羅燕春1，2田益農(nóng)1，2付海天1，2蘇文潘1，2彭靖茹1，2黎 萍1，2黃 強(qiáng)1，2侯學(xué)文3

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所1，南寧 530001)
(廣西壯族自治區(qū)木薯研究所2，南寧 530001)
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物生理研究室3，廣州 510642)

以雙波長分光光度法測定SC201、SC205、GR891和GR911共4個木薯品種生育期塊根中直鏈淀粉與支鏈淀粉含量的動態(tài)變化。結(jié)果表明，4個木薯品種塊根直鏈淀粉的含量是隨生育期的延長而逐漸增加的，而支鏈淀粉的含量卻緩慢下降，支鏈淀粉/直鏈淀粉的比例呈現(xiàn)下降趨勢，到12月份4個品種的這一比例已接近相同;以鮮重計的總淀粉含量，4個品種均呈逐漸增加的趨勢;而以干重計的總淀粉含量的變化則4個品種表現(xiàn)不一致。研究初步揭示了木薯塊根直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量的積累規(guī)律。

雙波長分光光度法 木薯 直鏈淀粉 支鏈淀粉

木薯(Manihot esculenta L)是大戟科木薯屬中唯一的栽培種，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，以塊根的形式儲存大量淀粉，木薯淀粉在淀粉食品、工業(yè)原料、生物能源等領(lǐng)域用途十分廣泛［1－4］。木薯淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成，木薯淀粉的構(gòu)成和含量對其收購價格影響很大，因此如何簡便快速測定木薯支鏈淀粉、直鏈以及總淀粉的含量具有很強(qiáng)的實用意義。測定淀粉的方法很多，如旋光法、國標(biāo)法、比色法、雙波長法和多波長法、碘親和力測定法、近紅外法、排阻色譜分析法、差示掃描量熱法、伴刀豆球蛋白法等［5－7］，但這些方法有的操作復(fù)雜，或者成本高，或者不能區(qū)分直鏈淀粉與支鏈淀粉，應(yīng)用受到限制。而淀粉的雙波長分光光度法則根據(jù)支鏈淀粉與碘生成棕紅色復(fù)合物，直鏈淀粉與碘生成深藍(lán)色復(fù)合物，它們的吸收光譜不同。通過直鏈淀粉與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)碘試劑處理后掃描獲得各自的吸收光譜，運(yùn)用作圖法找到適合測定直鏈淀粉與支鏈淀粉的兩種波長，并建立起直鏈淀粉與支鏈淀粉濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對待測樣品進(jìn)行處理后，同時采用4種波長對其進(jìn)行測定，就可分別求得直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量，并進(jìn)而求得總淀粉含量，本法具有簡便快速、成本低的特點［8］，已成為植物淀粉測定的常用方法［9－13］。本研究采用此方法，測定了SC201、SC205、GR891和GR911等木薯品種全生育期直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量的動態(tài)變化，本試驗結(jié)果有助于了解木薯塊根支鏈淀粉、直鏈淀粉和總淀粉的積累規(guī)律，為選擇恰當(dāng)?shù)哪臼聿墒諘r機(jī)以獲得期望的支鏈淀粉、直鏈淀粉、總淀粉含量以及支鏈淀粉/直鏈淀粉比例提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 材料的種植與采集

木薯SC201、SC205、GR891和GR911，均于2010年3月9日種植，株行距1×0．8 m，每小區(qū)7×11株，3個重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計?；?木薯淀粉渣3 t/ha，木薯專用肥1 250 kg/ha，追肥氯化鉀450 kg/ha。

分別于當(dāng)年7月9日、8月10日、9月8日、10月9日、11月8日和12月10日采樣，采樣時選取木薯3株，其中每小區(qū)1株，從中選有代表性的薯3條，從中部采樣100 g，于烘箱105℃下滅酶活15 min，于75℃烘24 h至恒重，干重與鮮重的比率為干物質(zhì)含量。木薯干片稱重后立即粉碎，過60目篩，于脂肪抽提器脫脂6 h，于80℃烘箱中處理2 h，儲存于封口袋并放置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．1．2 主要儀器與試劑

Lambda35紫外可見分光光度計:美國PerkinElmer公司;GR－200萬分之一電子天平:日本A＆D公司;DHG－9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實驗設(shè)備有限公司;HH－S4數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇金壇市醫(yī)療器械廠;DFT－100萬能粉碎機(jī):溫嶺市林大機(jī)械有限公司;索氏抽提器等;馬鈴薯直鏈淀粉與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品:美國Sigma公司;其余常規(guī)試劑石油醚、無水乙醇、氫氧化鉀、鹽酸、碘、碘化鉀均為國產(chǎn)分析純試劑。

碘試劑的配制，稱取碘化鉀2．0 g，溶于少量蒸餾水，再加碘0．2 g，待溶解后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中備用。

1．2 試驗方法

1．2．1 支鏈淀粉與直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與測定波長的確定

參考金玉紅等［9］方法，具體操作如下:稱取0．100 0 g直鏈淀粉純品，放在100 mL容量瓶中，加少量無水乙醇濕潤，加入1 mol/L KOH 10 mL，在75℃熱水浴中溶解后，取出加蒸餾水定容至100 mL，混勻，即為1 mg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0．3、0．5、0．7、0．9、1．1、1．3 mL放入50 mL容量瓶中，加入20～30 mL蒸餾水，以0．1 mol/L鹽酸調(diào)至溶液pH 3．5，加0．5 mL碘試劑，并用蒸餾水定容至刻度，混勻得濃度為0、6、10、14、18、22、26μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按上述方法制備1 mg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，取支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5、5．0 mL同法配制濃度為0、40、50、60、70、80、90、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

將用碘試劑處理的26μg/mL直鏈淀粉和100 μg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在紫外－可見光分光光度計上進(jìn)行400～1 000 nm波段光譜掃描，分別獲得二者的吸收光譜圖，用作圖法分別獲得支鏈淀粉與直鏈淀粉的測定波長與參比波長。

1．2．2 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將上述配制的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液在λ1和λ2兩波長下分別測定吸光度Eλ1、Eλ2，即得:ΔE值=Eλ1－Eλ2。以ΔE值為橫坐標(biāo)，直鏈淀粉濃度為縱坐標(biāo)，即得雙波長直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．3 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將上述配制的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在λ3和λ4兩波長下分別測定其吸光度Eλ3、Eλ4，即得:ΔE值=Eλ3－Eλ4。以ΔE值為橫坐標(biāo)，支鏈淀粉濃度為縱坐標(biāo)，即得雙波長支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．4 雙波長法測定木薯塊根中淀粉含量

稱取脫脂木薯淀粉樣品0．1 g左右，加少量無水乙醇濕潤，加1 mol/L KOH 10 mL，在熱水浴中振蕩15 min取出，在75℃熱水浴中溶解后，以蒸餾水定容至50 mL，靜置20 min。分別吸取3 mL作為樣品測定液和樣品空白液，均加入20～30 mL蒸餾水，以0．1 mol/L HCl調(diào)pH至3．5左右，在樣品測定液中加碘試劑0．5 mL，將樣品測定液和樣品空白液定容至50 mL混勻，靜置20 min，以樣品空白液為對照，用分光光度計測定樣品溶液在λ1、λ2、λ3、λ4這4個波長條件下的吸光度，根據(jù)直、支鏈淀粉的雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品的直、支鏈淀粉含量，二者相加求得樣品總淀粉含量。圖表中數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值。

1．2．5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用2003版Excel和7．05版DPS軟件，繪圖采用2003版Excel軟件。圖中誤差線是標(biāo)準(zhǔn)誤差，圖中標(biāo)注的不同大寫字母表示在1%水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 4個木薯品種生育期干物質(zhì)含量變化趨勢

從圖1可以看出，4個木薯品種塊根干物質(zhì)含量是逐漸增加的，其中GR891的干物質(zhì)含量一直是最高的;而SC201、GR911的干物質(zhì)含量最低。

圖1 4個木薯品種生育期塊根干物質(zhì)含量變化趨勢

2．2 雙波長法測定波長的選取

圖2是支鏈淀粉與直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)碘試劑處理后在400～1 000 nm的吸收光譜圖，根據(jù)雙波長法的原理得直鏈淀粉測定波長為λ1(633 nm)，參比波長為λ2(493 nm)，支鏈淀粉測定波長為λ3(557 nm)，參比波長為λ4(744 nm)。

圖2 支鏈淀粉、直鏈淀粉測定波長與參比波長的選取

2．3 支鏈淀粉與直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以測定波長為λ1(633 nm)，參比波長為λ2(493 nm)的OD值差值為橫坐標(biāo)，直鏈淀粉濃度為縱坐標(biāo)，獲得了直鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，其擬合方程為y=64．308x+0．120 3，R2=0．999 7，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線制作良好，直鏈淀粉質(zhì)量濃度在30μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖3 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

以測定波長為λ3(557 nm)，參比波長為λ4(744 nm)的OD值差值為橫坐標(biāo)，支鏈淀粉濃度為縱坐標(biāo)，獲得了支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，其擬合方程為y=347．64x+1．908，R2=0．995 2，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線制作良好，支鏈淀粉質(zhì)量濃度在100μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖4 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．4 4個木薯品種生育期淀粉含量變化趨勢

圖5是以干物質(zhì)計4個品種直鏈淀粉的變化趨勢，在7到11月份，4個品種的直鏈淀粉含量基本是逐漸增加的，其中7月到8月間增加顯著，說明這一時間段是直鏈淀粉快速積累期。在11月到12月4個品種直鏈淀粉含量略有下降，但二者差異不大，說明直鏈淀粉的合成基本停滯。從不同品種間來看，公認(rèn)的高粉品種GR891和SC205在整個測定周期均比GR911和SC201的直鏈淀粉含量高，在多數(shù)月份達(dá)到極顯著差異。

圖5 4個木薯品種生育期干物質(zhì)中直鏈淀粉含量變化趨勢

圖6是以干物質(zhì)計4個品種支鏈淀粉的變化趨勢，可以看出在4個品種中，支鏈淀粉的含量均是呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，再結(jié)合圖5直鏈淀粉是上升的趨勢，可以推測在這一時期直鏈淀粉的合成速度是快于支鏈淀粉的。從不同品種間來看，GR891的直鏈淀粉含量要明顯高于其他3個品種。

圖6 4個木薯品種生育期干物質(zhì)中支鏈淀粉含量變化趨勢

圖7 是以干物質(zhì)計4個品種總淀粉的變化趨勢。從不同品種間來看，兩個公認(rèn)的高粉品種GR891、SC205在測定開始時，總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)就很高，分別為(71．00±0．35)%、(68．28±0．33)%，在12月份時分別明顯下降為(63．89±2．61)%、(56．44±0．32)%。而兩個低粉品種GR911、SC201在7月份測定開始時淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)就比較低，分別為(52．08±0．46)%、(50．20±0．29)%，在生育期中總淀粉含量經(jīng)歷上升與下降的震蕩變化，在12月份收獲時其淀粉含量與7月份沒有差異。

圖7 4個木薯品種生育期干物質(zhì)中總淀粉含量變化趨勢

圖8 是以鮮重計4個品種總淀粉的變化趨勢，從圖8中可以看出，4個品種的鮮重淀粉含量均是逐漸上升的。從不同品種間來看，兩個高粉品種GR891、SC205的鮮重淀粉含量均比GR911、SC201的高，特別是GR891表現(xiàn)更為突出，在8月到12月顯著高于其他3個品種。

圖8 4個木薯品種生育期鮮重中總淀粉含量變化趨勢

圖9 是4個品種支鏈淀粉/直鏈淀粉比例的變化情況，從圖9中可以看出，4個品種的這一比例均是逐漸下降的，這一結(jié)果再次表明，木薯塊根在7月至12月間直鏈淀粉的合成速度要快于支鏈淀粉。從不同品種間來看，SC201在7月份的支鏈淀粉/直鏈淀粉比例達(dá)20．8倍，遠(yuǎn)高于GR891的11．5倍、GR911的12．9倍和SC205的9．8倍，但到8月份這一比例快速下降，隨后這一比例持續(xù)緩慢下降，到11與12月份時4個品種的比例基本接近，已經(jīng)沒有差異。

圖9 4個木薯品種生育期支鏈淀粉/直鏈淀粉變化趨勢

3 結(jié)論

在試驗中采用雙波長分光光度法研究了4個木薯品種生育期中支鏈淀粉直鏈淀粉、總淀粉以及支鏈淀粉/直鏈淀粉比例的變化動態(tài)。結(jié)果表明在整個生育期，直鏈淀粉在總淀粉中的含量是逐漸上升，而支鏈淀粉在總淀粉中的含量是逐漸降低的，導(dǎo)致支鏈淀粉/直鏈淀粉的比例逐漸下降。以鮮重計的總淀粉含量在整個生育期4個品種均是逐漸上升的，但以干重計的總淀粉含量則變化相對比較平穩(wěn)。雖然淀粉積累的變化趨勢在4個品種中均相同，但在含量水平上4個品種間還是具有明顯差異，比如公認(rèn)的高粉品種GR891在支鏈淀粉含量、總淀粉含量方面明顯高于其他3個品種，而在直鏈淀粉含量方面與另一高粉品種SC205比較接近，但均高于GR911和SC201。品種SC201在10月份前其支鏈淀粉/直鏈淀粉的比例均顯著高于其他3個品種，但在11月份后4個品種間已經(jīng)沒有差異，這些結(jié)果說明這4個品種間直鏈淀粉、支鏈淀粉的積累速率是有差異的。研究結(jié)果為栽培時品種選擇、收獲時機(jī)選擇提供了參考。

［1］伍玉碧．木薯及木薯淀粉的開發(fā)利用［J］．木薯精細(xì)化工，2001，8(1):1－4

［2］古碧，李開綿，李兆貴，等．不同木薯品種(系)塊根淀粉特性研究［J］．熱帶作物學(xué)報，2009，30(12):1876－1881

［3］邵乃凡．國內(nèi)外木薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢及加快廣西木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的建議［J］．淀粉與淀粉糖，2009(2):1－3

［4］王亞靜，畢于運(yùn)，唐華?。袊茉醋魑镅芯窟M(jìn)展及發(fā)展趨勢［J］．中國科技論壇，2009(3):124－129

［5］陳旭紅．旋光法測定木薯粗淀粉的含量［J］．食品工業(yè)科技，2000，2(2):64－65

［6］Grant LA，Ostenson AM，Rayas Duarte P．Determination of Amyose and Amylopectin of wheat Starch Using High Performance Sizeexclusion Chromat ography(HPSEC)［J］．Cereal Chemistry，2002，79(6):771－773

［7］許冬青，彭黔榮，楊敏，等．煙草中淀粉測定方法研究現(xiàn)狀與探討［J］．耕作與栽培，2011:54－56

［8］戴雙，程敦公，李豪圣，等．小麥直、支鏈淀粉和總淀粉含量的比色快速測定研究［J］．麥類作物學(xué)報，2008，28(3):442－447

［9］金玉紅，張開利，張興春，等．雙波長法測定小麥及小麥芽中直鏈、支鏈淀粉含量［J］．中國糧油學(xué)報，2009，24(1):137－140

［10］王春霞，孫領(lǐng)霞，劉滿英．雙波長分光光度法測定河北省多種糧豆作物中直、支鏈淀粉含量［J］．光譜實驗室，1999，16(3):259－261

［11］劉向農(nóng)，余碧鈺．雙波長分光光度法測定銀杏果仁中直鏈淀粉和支鏈淀粉［J］．光譜實驗室，2000，17(5):506－509

［12］范明順，張崇玉，張琴，等．雙波長分光光度法測定高粱中的直鏈淀粉和支鏈淀粉［J］．中國釀造，2008:85－87

［13］加列西·馬那甫，景偉文，削合來提·再?。p波長法測定谷類和豆類作物籽粒中直鏈和支鏈淀粉的含量［J］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47(3):564－568．

Time Course of Starch Content in Cassava Root Tuber Determined by Dual－Wavelength Spectrophotometry

Huang Huifang1，2Luo Yanchun1，2Tian Yinong1，2Fu Haitian1，2Su Wenpan1，2Peng Jingru1，2Li Ping1，2Huang Qiang1，2Hou Xuewen3
(Subtropical Crops Research Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region1，Nanning 530001)
(Cassava Research Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region2，Nanning 530001)
(Lab of Molecular Plant Physiology，College of Life Sciences，South China Agricultural University3，Guangzhou 510642)

The time course of amylase and amylopectin content in root tuber of four cassava cultivars，SC201，SC205，GR891and GR911，were determined by dual－wavelength spectrophotometry．The results showed that:the amylose content of cassava root tuber of four cultivars gradually increase in the time course，however the amylopectin decreased along with the growth period，and the ratios of amylopectin/amylose of four cultivars were decreased continuously，by December，their ratios were very close to 1∶1．The starch content by fresh weight in four cultivars also increased，while the starch content by dry weight in four cultivars were different．This research revealed the accumulation rule of amylose，amylopectin and total starch of cassava root tuber．

dual－wavelength spectrophotometry，cassava，amylose，amylopectin

S533

A

1003－0174(2012)10－0113－05

廣西主席基金(09203－03)

2012－01－04

黃惠芳，女，1969年出生，高級工程師，植物生物化學(xué)研究

黃強(qiáng)，男，1967年出生，高級農(nóng)藝師，生物技術(shù)、品種引進(jìn)

侯學(xué)文，男，1969年出生，研究員，博士研究生導(dǎo)師，植物生物技術(shù)