巴西松籽蛋白超聲輔助超濾提取工藝及功能特性研究

蔡路昀 劉長(zhǎng)虹 曹愛(ài)玲 應(yīng)鐵進(jìn)

巴西松籽蛋白超聲輔助超濾提取工藝及功能特性研究

蔡路昀1劉長(zhǎng)虹1曹愛(ài)玲2應(yīng)鐵進(jìn)1

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院1，杭州 310058)
(蕭山出入境檢驗(yàn)檢疫局2，杭州 311208)

為了提高巴西松籽蛋白提取效率和功能特性，采用超聲輔助超濾提取工藝結(jié)合響應(yīng)面分析，并與傳統(tǒng)提取工藝松籽蛋白進(jìn)行比較。結(jié)果顯示:超聲輔助超濾提取工藝可以顯著提高松籽蛋白的得率和功能特性，其中最佳提取條件是:超聲溫度43℃，pH值9，超聲功率400 W，超聲時(shí)間38 min，料液比1∶35，提取效率為77．94%，同時(shí)超濾提取的松籽蛋白在容積密度，乳化性，起泡能力和起泡穩(wěn)定性等功能特性上都要優(yōu)于傳統(tǒng)提取的松籽蛋白及部分植物蛋白。這些結(jié)果表明，松籽蛋白作為可利用的植物蛋白來(lái)源可以廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。

松籽蛋白 超聲 超濾 響應(yīng)面 功能特性

巴西松籽(Pinus gerardiana W．ex D．)主要分布在喜馬拉雅山區(qū)，如阿富汗東部，巴基斯坦北部，印度查謨克什米爾地區(qū)和我國(guó)的西藏，常年生長(zhǎng)在海拔2 000～3 350 m的山谷中。巴西松籽作為一種地區(qū)貿(mào)易商品，消費(fèi)潛力巨大，由于其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，其不飽和脂肪酸占總脂肪酸的91．54%［1］，同時(shí)與國(guó)內(nèi)紅松松籽相比，更易手剝食用，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)的消費(fèi)量呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢(shì)。巴西松籽以烘炒為主要加工手段，可用于甜食、paste中或者作為色拉的配料，但對(duì)其精深加工的相關(guān)研究甚少。多年來(lái)，植物蛋白作為一種來(lái)源豐富的高品質(zhì)蛋白質(zhì)受到極大關(guān)注［2－3］，作為植物蛋白的松籽蛋白占總成分的20%以上，且氨基酸組成合理，尤其富含精氨酸［4］，可降低因心血管疾病引發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，因此，研究松籽蛋白的提取工藝對(duì)松籽資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

超濾技術(shù)是食品工業(yè)中最受人歡迎的分離技術(shù)之一，能截留大分子蛋白質(zhì)從而去除小分子物質(zhì)［5］，能去除一些抗?fàn)I養(yǎng)的成分，如蛋白酶和淀粉酶抑制劑，外源凝集素等，同時(shí)改善蛋白的功能性質(zhì)［6－7］。超聲輔助處理通過(guò)減少處理時(shí)間和溶劑損耗從而顯著改進(jìn)提取效率，也可以改善蛋白的理化及功能特性［8－9］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者利用堿溶，超聲輔助提取，鹽溶等提取松籽蛋白，然后采用等電點(diǎn)沉淀等方法進(jìn)行分離，取得了一定的效果［10－11］，在提取率上有所提高，但在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能特性上沒(méi)有改進(jìn)，國(guó)外甚少有關(guān)于松籽蛋白的分離提取研究，通過(guò)超聲輔助提取松籽蛋白，同時(shí)用超濾技術(shù)分離蛋白的研究鮮見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，因此，本試驗(yàn)通過(guò)超聲輔助提取和超濾分離松籽蛋白，利用響應(yīng)面分析(RSM)優(yōu)化松籽蛋白的提取工藝并測(cè)定所得松籽蛋白的化學(xué)組分和功能特性，以期為松籽蛋白的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1．1 材料

巴西松籽(Pinusgerardiana W．ex D．)于2010年9月采自巴基斯坦北部山區(qū)，海拔2 000米以上，采收后冷藏空運(yùn)回國(guó)，去除雜質(zhì)和壞籽，放入塑料罐中，封口，然后在－3℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 儀器與設(shè)備

Kjeltec2300全自動(dòng)凱氏定氮儀:丹麥Foss公司;KQ500DB超聲波清洗器:昆山超聲儀器有限公司;722E型可見(jiàn)分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司;Labscale型TFF超濾系統(tǒng):美國(guó)Millipore公司;BR4i冷凍離心機(jī):法國(guó)Jouan公司;Alpha 1－4 LSC冷凍干燥機(jī):德國(guó)Christ公司。

1．3 松籽蛋白的制備工藝流程

松籽蛋白的制備工藝流程如下所示。

新鮮巴西松籽→正已烷脫脂(×2)→干燥粉碎→超聲輔助提取→離心取上清→超濾分離→冷凍干燥→松籽蛋白

1．3．1 去脂松籽粉的準(zhǔn)備

巴西松子仁磨碎后，與正己烷按照1:10比例混勻，然后磁力攪拌提取1 h，去上清，重復(fù)提取1次，將剩余物放在通風(fēng)櫥中干燥以去除水分和殘留的溶劑，最后將已去脂的松籽磨成粉，過(guò)80目篩，放入密封的塑料袋中，－20℃保存待用。

1．3．2 超聲輔助提取與響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

稱取1 g去脂松籽粉，根據(jù)不同的提取參數(shù)(pH，料液比，超聲溫度，超聲功率，超聲時(shí)間)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以松籽蛋白的提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)原理，用響應(yīng)面方法來(lái)評(píng)估不同參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，并最終得出優(yōu)化的提取條件。

以松籽蛋白的提取率作為響應(yīng)值，根據(jù)Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲溫度X1，超聲處理時(shí)間X2，料液比X3這3個(gè)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)(RSM)，共設(shè)立了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)，用來(lái)估計(jì)誤差，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平如表1所示，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平

表2 RSM試驗(yàn)方案及結(jié)果

蛋白提取率=(提取液中的蛋白含量/去脂粉中的蛋白含量)×100%，去脂粉中的蛋白含量根據(jù)凱氏定氮法測(cè)定，其中氮轉(zhuǎn)化因子N=5．30，提取液中的蛋白質(zhì)含量用Bradford的方法進(jìn)行測(cè)定。

1．3．3 超濾制備松籽蛋白

蛋白提取液勻漿在5 000 r/min，4℃條件下離心20 min，上清液用分離點(diǎn)10 ku的濾膜進(jìn)行切向流超濾，調(diào)節(jié)蛋白提取物pH值至7．0，然后真空冷凍干燥得到松籽蛋白(UPP)。同時(shí)與傳統(tǒng)堿提酸沉的松籽蛋白(IPP)進(jìn)行對(duì)比分析。

1．4 松籽蛋白的化學(xué)組分和功能特性

1．4．1 大致組分測(cè)定，其中粗蛋白含量測(cè)定:凱氏定氮法(GB5009．5—2010);粗脂肪含量測(cè)定:索氏提取法(GB5512—2008);水分含量測(cè)定:105℃恒重法(GB5497—1985);灰分含量測(cè)定:550℃灼燒法(GB5505—1985)。

1．4．2 容積密度采用文獻(xiàn)［12］的方法，松籽蛋白的容積密度用每毫升蛋白的重量來(lái)表示(g/mL)。

1．4．3 最小凝膠濃度通過(guò)文獻(xiàn)［13］的方法測(cè)定，將松籽蛋白用蒸餾水調(diào)節(jié)成不同濃度的溶液，首先在沸水浴加熱1 h，而后迅速冷卻并放入4℃冰箱中2 h，最后將管子倒置過(guò)來(lái)而樣品沒(méi)有掉落即為最小凝膠濃度。

1．4．4 乳化性采用文獻(xiàn)［14］的方法，取一定量松籽蛋白溶解到50 ml 0．1 mol/L的NaCl溶液中，在調(diào)整pH后，加入50 mL大豆油，在高速勻漿機(jī)中攪拌3 min，然后轉(zhuǎn)移到量筒中并在25℃保持15 min，記錄下乳化層體積和總體積，其中乳化性=(乳化層體積/總體積)×100%。

1．4．5 起泡性采用文獻(xiàn)［15］的方法，進(jìn)行略微修改，取0．1 g松籽蛋白溶解到20 mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH，15 000 r/min攪拌2 min后倒入量筒中，15 s和120 min后分別記錄起泡的體積，其中起泡能力=(15 s后起泡的體積/攪拌前體積)×100%，起泡穩(wěn)定性=(靜置120 min后起泡的體積/靜置前起泡的體積)×100%

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 松籽蛋白超聲輔助提取的最佳條件

選取超聲處理時(shí)間、超聲溫度、pH值、超聲功率、料液比共5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以此來(lái)測(cè)定各個(gè)因素對(duì)松籽蛋白提取率的影響。

pH值對(duì)蛋白提取率的影響，設(shè)置料液比1∶20，超聲溫度35℃，超聲功率400 W，超聲處理時(shí)間30 min(圖1a)，結(jié)果顯示，松籽蛋白的提取率伴隨著pH值的升高而顯著增加，說(shuō)明堿性pH可以疏松蛋白結(jié)構(gòu)，增加蛋白溶解性，但是過(guò)高的堿性也會(huì)導(dǎo)致蛋白發(fā)生變性，破壞蛋白品質(zhì)。因此選擇pH 9作為松籽蛋白提取的條件。

料液比對(duì)蛋白提取率的影響，設(shè)置pH 9，超聲溫度35℃，超聲功率400 W，超聲處理時(shí)間30 min(圖1b)，結(jié)果顯示，隨著料液比增加，蛋白提取率增加，但當(dāng)料液比達(dá)到1:30后提取率沒(méi)有顯著增加，因此選擇料液比1:30作為提取條件。

超聲溫度對(duì)蛋白提取率的影響，設(shè)置pH 9，料液比1:30，超聲功率400 W，超聲處理時(shí)間30 min(圖1c)，當(dāng)提取溫度從25℃升至45℃，提取率顯著增加，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高，提取率非但沒(méi)有上升，反而呈下降趨勢(shì)，這歸因于高溫所引發(fā)的蛋白質(zhì)變性，形成絮狀沉淀從而降低了蛋白質(zhì)的溶解度［16］。因此選擇溫度45℃作為蛋白提取的條件。

超聲功率對(duì)蛋白提取率的影響，設(shè)置pH 9，料液比1∶30，超聲溫度45℃，超聲處理時(shí)間30 min(圖1d)，在400 W之前，蛋白提取率隨著超聲功率的增加而增加，400 W之后，隨著超聲功率增加，提取率非但沒(méi)有增加反而減少，這可能是由于超聲功率過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一些降解蛋白酶溶出，從而降低蛋白得率［9］。

超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響，設(shè)置pH 9，料液比1∶30，超聲溫度45℃，超聲功率400 W(圖1e)，提取時(shí)間在20～40 min內(nèi)，蛋白提取率顯著升高，在40 min時(shí)，達(dá)到最大值75．44%，40 min后，提取率逐漸下降，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲處理所產(chǎn)生的熱效應(yīng)破壞蛋白結(jié)構(gòu)，從而降低了蛋白的提取率。

圖1 不同因素對(duì)松籽蛋白提取率的影響

采用Design expert 7試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行二次回歸擬合，得到回歸方程:

進(jìn)一步對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)P值遠(yuǎn)低于0．01，這說(shuō)明Quadratic模型是顯著的，同時(shí)失擬誤差的P值大于0．05，回歸方程的系數(shù)R2=0．974，這些都說(shuō)明此模型可被用來(lái)預(yù)測(cè)響應(yīng)值。

為確定松籽蛋白超聲輔助提取的最優(yōu)條件，根據(jù)預(yù)測(cè)方程進(jìn)行了三維曲面圖分析。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)響應(yīng)面都是凸面的，而且3個(gè)因素與蛋白提取率之間存在拋物線關(guān)系。對(duì)回歸方程進(jìn)行數(shù)學(xué)分析得出，超聲輔助提取的最佳條件是:超聲溫度42．91℃，超聲處理時(shí)間37．53 min，料液比1∶35，此時(shí)蛋白的理論提取率是78．34%，考慮到實(shí)際情況，將提取條件修正為超聲溫度43℃，超聲處理時(shí)間38 min，料液比1∶35，超聲功率400W，pH值為9，為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的有效性，用所得的優(yōu)化條件重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)得松籽蛋白提取率為77．94%，和理論提取率相近，與傳統(tǒng)的提取方法相比(62．09%)，超聲輔助提取的松籽蛋白提取率提高了26%，因此超聲輔助有助于顯著提高松籽蛋白的提取率。

2．2 松籽蛋白的大致組分

通過(guò)超濾提取的巴西松籽蛋白(UPP)和傳統(tǒng)提取的巴西松籽蛋白(IPP)的大致組分如表3所示，超濾松籽蛋白比傳統(tǒng)提取的松籽蛋白含有更高的蛋白含量(P＜0．01)，更少的脂肪，水分和灰分。同時(shí)，經(jīng)過(guò)超濾后，去除了小分子質(zhì)量肽段，分離物具有不同的蛋白分段，由此，蛋白所具有的一些對(duì)食品加工重要的理化及功能特性可能會(huì)產(chǎn)生變化。

圖2 溫度和時(shí)間、溫度和料液比、時(shí)間和料液比對(duì)松籽蛋白提取率的響應(yīng)面圖

表3 巴西松籽蛋白UPP和IPP的大致組分

2．3 超濾分離巴西松籽蛋白的功能特性

2．3．1 巴西松籽蛋白的容積密度和最小凝膠濃度

表4所示的是通過(guò)超濾和傳統(tǒng)提取方法提取的松籽蛋白的容積密度和最小凝膠濃度。可以看出，超濾松籽蛋白的容積密度(0．35 g/mL)要高于傳統(tǒng)提取松籽蛋白(0．28 g/mL)，也高于通過(guò)超濾提取的葵花籽蛋白(0．27 g/mL)［17］，容積密度取決于相關(guān)因素的相加效應(yīng)，比如相互吸引的顆粒間的強(qiáng)度，顆粒大小和接觸點(diǎn)的數(shù)量等等，更高的容積密度有利于嬰幼兒食品制作中減少產(chǎn)品的容積［18－19］

超濾提取松籽蛋白的最小凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)(12%)高于傳統(tǒng)提取松籽蛋白(8．67%)，這個(gè)結(jié)果與測(cè)得的大豆蛋白(9．7%～11%)，菜籽蛋白(14．9%～15．7%)［20］，葵花籽蛋白(10%)［21］的最小凝膠濃度相類似。凝膠過(guò)程是一個(gè)多步驟的過(guò)程，依賴于蛋白的來(lái)源和類型還有試驗(yàn)的條件等等，其中所含有的非蛋白成分可能占據(jù)了重要的作用［22－23］。

2．3．2 巴西松籽蛋白的乳化性和起泡性

超濾提取松籽蛋白(UPP)與傳統(tǒng)提取松籽蛋白(IPP)的乳化性和起泡性如表4所示。乳化性是蛋白的重要功能特性之一，蛋白質(zhì)的親水疏水雙重性質(zhì)有利于顯著減少油水界面之間的強(qiáng)度和空隙［24］，UPP的乳化性要高于IPP，且高于已知的花生蛋白和葵花籽蛋白的乳化性［12，17］，進(jìn)一步說(shuō)明了松籽蛋白可作為一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白應(yīng)用在食品工業(yè)中。

蛋白的起泡能力主要取決于他的可溶性蛋白片段，但是不溶性的蛋白顆?；蛘咂渌煞直热缣妓衔锏拇嬖趯?duì)起泡性能也起到一定的作用［25］。研究結(jié)果顯示，超濾提取的松籽蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性要均好于傳統(tǒng)提取的松籽蛋白，說(shuō)明不同的蛋白分離方法產(chǎn)生了不同的蛋白片段和其他的化學(xué)組分，這些共同決定了蛋白的起泡性能。

表4 巴西松籽蛋白的功能性特性

3 結(jié)論

超聲輔助超濾提取顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的提取方法，同時(shí)提高了松籽蛋白的得率和功能特性。巴西松籽蛋白良好的乳化性可以用在色拉、蛋黃醬等制作上，較好的起泡性可以用在制作蛋糕、冰淇淋和甜點(diǎn)上，以上結(jié)果均顯示巴西松籽蛋白可以在食品工業(yè)中作為好的蛋白質(zhì)配方的來(lái)源之一。

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Study on Functional Properties of Chilgoza Pine Nut Protein Extracted by Ultrasonic－Assisted Ultrafiltration

Cai Luyun1Liu Changhong1Cao Ailing2Ying Tiejin1
(School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University1，Hangzhou 310058)
(Xiaoshan Entry－ E xit Inspection and Quarantine Bureau2，Hangzhou 311208)

In this study in order to increase the extraction efficiency and functional properties of Chilgoza pine nut protein，prepared by ultrasonic－assisted extraction and ultrafiltration in combination with response surface methodology were analyzed in comparison with the protein obtained by traditional extraction．The extraction efficiency and functional properties of pine nut protein was significantly improved by the ultrasonic－assisted extraction and ultrafiltration method．The optimum extraction condition was as follows:ultrasonic temperature 43℃ ，pH value 9，ultrasonic power 400 W，ultrasonic treatment time 38 min，solid/liquid ratio 1:35，the extraction efficiency was 77．94%．Functional properties(bulk density，emulsifying capacity，foaming capacity and foam stability)of pine nut protein obtained by ultrafiltration were found to be better than that of traditionally extracted protein and some of other plant proteins．The results of this study indicated pine nut protein as an available plant protein source could be widely applied in food industry．

pine nut protein，ultrasonic，ultrafiltration，response surface，functional properties

TS201．2

A

1003－0174(2012)10－0070－06

2012－01－13

蔡路昀，男，1981年出生，博士，農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)藏加工

應(yīng)鐵進(jìn)，男，1958年出生，教授，博士生導(dǎo)師，農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)藏加工