植物油中甾醇組成及總量測定方法的改進

朱 琳 張 蕊 薛雅琳 馬 榕

植物油中甾醇組成及總量測定方法的改進

朱 琳 張 蕊 薛雅琳 馬 榕

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

在2個國際標準方法ISO 12228和COI/T．20/Doc．no．10的基礎上，對植物油中甾醇組成及總量的檢測方法進行了改進，并將改進方法與2個國際標準方法進行了比較。結(jié)果表明:在測定植物油中甾醇組成及總量時，選用5α－膽甾烷基－3β－醇作為內(nèi)標，氧化鋁柱提取不皂化物，99%雙三甲基硅基三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷和等體積的無水嘧啶作為衍生劑以及采用恒溫氣相檢測條件不僅提高了檢測速度，還降低了操作難度及操作成本。同時，使用改進后的方法對10個不同的植物油樣進行了重復性驗證，結(jié)果重復性均在國際標準方法要求范圍之內(nèi)。

植物油 甾醇組成 甾醇總量 檢測 改進 氣相色譜法

植物甾醇是以環(huán)戊烷多氫菲(又稱甾核)為骨架的一類甾體化合物，如圖1所示。隨著C17及R所含雙鍵數(shù)目的多少和位置的差異，該分子結(jié)構(gòu)代表了不同種類的植物甾醇［1－2］。多數(shù)甾醇的C－5位為雙鍵，C－3位為羥基是重要的活性基團之一，甾醇通過它形成各種衍生物，甾醇的這種結(jié)構(gòu)特點決定了它多方面的生理特性，它具有降膽固醇、抗腫瘤等生理功能［3］。植物油中含有豐富的植物甾醇，是人體攝入植物甾醇的重要來源，對于不同種類的植物油其甾醇組成及總量不同，而對于同一種類的植物油，甾醇組成及總量又是相對固定的，因此甾醇組成及總量也可以作為植物油的特征指紋，是檢測油品是否摻偽的重要指標之一［4］。鑒于測定甾醇組成及總量有如此重要的作用，建立一個方便快捷的方法是很有必要的。

圖1 環(huán)戊烷多氫菲(又稱甾核)

目前分析測定植物甾醇的方法較多。早期有毛地黃皂甙法、比色法、酶法等，但這些方法只能測定甾醇總量，不能有效分離甾醇組分并定量。有文獻報道化學法、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)等，其中氣相色譜法分離效果好、分析速度快、靈敏度高、操作簡便，已被國際、國內(nèi)標準采用［5］。本試驗在測定植物油中甾醇組成及總量的兩項國際標準方法(ISO和COI)的基礎上，對內(nèi)標的選擇、不皂化物的提取方式、甾醇衍生化以及色譜條件等方面進行了優(yōu)化，使得改進后的方法降低了檢測成本并易被分析技術(shù)人員所掌握。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

食用油樣品:市售，玉米油3個，添加甾醇酯的玉米油、花生油各2個，米糠油、橄欖油、葵花籽油各1個。

1．2 試劑

內(nèi)標及衍生劑:alfa公司和sigma公司;100～200目中性氧化鋁:上海五四化學試劑有限公司;20 cm×20 cm硅膠薄層板，厚度0．25 mm:青島海洋化工廠;2，7－二氯熒光黃:北化恒業(yè)。

1．3 儀器

7890A氣相色譜儀(FID檢測器):安捷倫(Agilent)公司;紫外燈(波長254 nm):瑞士卡瑪(CAMAG)公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:瑞士步琪(Buchi)公司。

1．4 方法

方法1:COI/T．20/Doc．no．10/Rev．1氣相色譜法測定甾醇組成及甾醇含量［6］。

方法2:ISO12228:2008動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法［7］。

具體操作步驟見表1。

表1 3種甾醇組成及總量檢測方法

表2 3種方法對不同油樣分析測定結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2．1 樣品色譜分析

同一樣品采用3種不同方法得到的典型色譜圖，見圖2～圖4，3種不同方法各甾醇組分均得到了較好的分離。

圖3 方法2提取甾醇的氣相色譜圖

2．2 3種方法分析結(jié)果比對

圖4 改進方法提取甾醇的氣相色譜圖

對玉米油1#樣、添加甾醇酯的玉米油1#樣、米糠油1#樣進行了甾醇組成及總量的分析測定，3種測定方法的結(jié)果與數(shù)據(jù)見表2。可以看出，采用改進方法與方法1、方法2測得的甾醇組成及總量的結(jié)果并無明顯差異。但由于方法1、改進方法選擇的內(nèi)標是5α－膽甾烷基－3β－醇，使得色譜分析時內(nèi)標物與膽固(甾)醇的保留時間較接近，得到的膽甾醇含量會略高于方法2的分析結(jié)果。

2．3 采用改進方法測定不同品種植物油的重復性

由表3數(shù)據(jù)可以看出，改進方法分析樣品的甾醇總量在1 441～18 240 mg/kg之間，其重復性在9．15～176．62之間，符合方法二甾醇總量約為2 000～8 000 mg/kg范圍時，重復性應在186．90～489．00之內(nèi)的要求。因此，證實改進的方法重復性良好，滿足植物油甾醇定量分析要求。

表3 改進方法對不同油樣分析測定結(jié)果

表4 3種測定方法的優(yōu)缺點比較表

2．4 討論

對2種測定方法的優(yōu)缺點進行了詳細的比較，詳見表4。

從表4可以看出:改進方法是在方法1、方法2的基礎上，通過整合了各分析步驟的優(yōu)點而形成的。

在選擇內(nèi)標時，方法2添加1 mL 1．0 mg/mL的內(nèi)標，內(nèi)標的峰面積比例偏大，從而影響低含量甾醇組分的測定結(jié)果。改進的方法首先考慮到植物油甾醇總量在100～22 100 mg/kg范圍內(nèi)變化［8］，根據(jù)甾醇總量的不同，合理的選擇內(nèi)標添加量。從成本方面看，改進方法內(nèi)標5α－膽甾烷基－3β－醇(即膽甾烷醇)價格約為40元/g，而方法2樺木醇價格約1 500元/g。

在提取不皂化物時，改進方法采用氧化鋁柱來提取，不僅節(jié)省了乙醚的用量，也提高分析速度。而方法1提取不皂化物需要耗用大量的乙醚，易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象且費時。

在選擇甾醇的薄層噴顯劑時，改進的方法選用堿板，2，7－二氯熒光黃的乙醇溶液噴淋，劑量易控制、顯色持久，條帶邊界清晰，也減少了操作過程可能對實驗者的身體傷害，且易于操作。而方法2使用甲醇溶液噴淋時，劑量難以控制、顯現(xiàn)時間短，二次噴淋易造成邊界不清晰，甲醇揮發(fā)易致人中毒。

在選擇硅烷化試劑時，改進的方法選擇BSTFA+TMCS(99∶1)和同比例的無水嘧啶作為硅烷化試劑，衍生只需要在室溫下完成，10 mL玻璃試管即可作為反應瓶，試劑成本降低了十幾倍。而方法2所用的衍生劑需在高溫下進行，且需耐溫、密閉性好的反應瓶。

改進方法分析速度快，50 min即可，且峰分離度滿足要求，而方法2的色譜分析時間超過了70 min。

3 結(jié)論

通過3種方法分析步驟的對比可以看出，改進的方法具有以下優(yōu)點:選擇的內(nèi)標與添加量合理且成本較低;不皂化物提取省時、省試劑;選用的薄層噴顯劑顯色持久，條帶邊界清晰;甾醇衍生化試劑成本低廉，操作簡便;縮短了氣相色譜分析的時間。

通過3種方法分析不同樣品結(jié)果的比較以及對改進方法重復性的驗證，結(jié)果表明，改進的方法不僅快速穩(wěn)定，重復性滿足定量分析要求，且適用各種植物油中不同甾醇組成及總量的分析。

［1］楊振強，謝文磊，李海濤，等．植物甾醇的開發(fā)與應用研究進展［J］．糧油加工與食品機械，2006(1):53－56

［2］曹瑩，谷克仁，孟冬，等．植物甾醇提取方法研究進展［J］．糧油食品科技，2006，14(5):25－28

［3］彭鶯，劉福禎，高欣．天然植物甾醇的應用與提取工藝［J］．化工進展，2002，21(1):49－53

［4］張蕊，薛雅琳，朱琳，等．橄欖油中甾醇組成及總量測定方法的探討［J］．中國油脂，2011，36(8):77－80

［5］馮妹元，韓軍花，劉成梅，等．常見精練油中植物甾醇測定方法的建立及含量分析［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18(3):197－201

［6］COI/T．20/doc．no．10/rev．1－2001，Determination of the composition and content of sterols by capillary－column gas chromatography［S］

［7］ISO12228—1999，Animal and vegetable fats and oils－determination of individual and total sterols contents－gas chromatographic method［S］

［8］Codex－stan 210—1999，Codex standard for named vegetable oils［S］．

Improvement of the Measuring Methods of Composition and Total Contents of Sterols in Vegetable Oils

Zhu Lin Zhang Rui Xue Yalin Ma Rong
(Science Academy of State Grain Administration，Beijing 100037)

The determination of composition and total contents of sterols in vegetable oils is improved on the basis of the two international standard methods(ISO and COI)．The improvement method is compared with two international standard methods．The optimum conditions are obtained as follows:5α－cholestan－3β－ol as internal standard，aluminium oxide column，99%bistrimethylsilyl trifluor acetamide+1%trimethyl chlorosilane and an equal volume of anhydrous pyridine as silanization reagent，and the constant temperature gas phase detection conditions．The results indicate that the method is rapid，simple and cost saving．Meanwhile，the repeatability of the improved method is verified by detecting ten vegetable oil samples．It is in the range of international standard method required．

vegetable oils，composition of sterol，total contents of sterol，inspection，improvement，gas chromatography

TQ646

A

1003－0174(2012)08－0109－05

2011－11－08

朱琳，女，1984年出生，生物工程

薛雅琳，女，1960年出生，教授級高級工程師，糧油品質(zhì)及標準