烏桕梓油中四酯的分離及鑒定

尹立軍 陸向紅 盧美貞 薛 蓉 竇 曉 計(jì)建炳

烏桕梓油中四酯的分離及鑒定

尹立軍 陸向紅 盧美貞 薛 蓉 竇 曉 計(jì)建炳

(浙江省生物質(zhì)燃料利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，杭州 310014)

烏桕梓油中含有一種特殊結(jié)構(gòu)的四酯成分。利用柱層析技術(shù)對(duì)烏桕梓油中的四酯進(jìn)行分離。采用紫外分光光度法(UV)、氣相色譜(GC)、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)和高效液相色譜(HPLC)對(duì)分離樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明，柱層析適宜的分離條件為:硅膠為吸附劑，95%石油醚和乙酸乙酯的混合溶液為洗脫劑，洗脫劑流速為1 mL/min，硅膠用量為17 g/g梓油。在此條件下可以得到純度為98%的梓油四酯產(chǎn)品，其收率為54．8%。

四酯 梓油 柱層析

烏桕為大戟科烏桕屬植物，是我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種，分布在長(zhǎng)江流域以南地區(qū)，具有生長(zhǎng)快、籽出油率高(40%～50%)的特點(diǎn)［1］，被我國(guó)列為四大木本油料作物之一，其籽油可用于制取生物柴油［2］。

烏桕籽果仁榨取的油脂稱(chēng)為梓油。梓油具有旋光性，分析梓油甘油酯的脂肪酸組成發(fā)現(xiàn)，梓油甘油酯中含有2，4癸二烯酸［3－5］，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)梓油中含有一種普通植物油沒(méi)有的、結(jié)構(gòu)特殊的四酯［6］(梓油四酯，estolide)，梓油四酯的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。該四酯在梓油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%左右。梓油四酯分子含有兩種結(jié)構(gòu)特殊的中長(zhǎng)鏈脂肪酸8－羥基5，6辛二烯酸和2，4癸二烯酸，這兩種烯酸含有多種官能團(tuán)，性能活潑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和研究意義。

圖1 梓油四酯的分子結(jié)構(gòu)

本試驗(yàn)對(duì)柱層析技術(shù)從烏桕梓油中分離甘油四酯進(jìn)行研究，采用紫外分光光度法(UV)、氣相色譜(GC)、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)和高效液相色譜(HPLC)對(duì)分離樣品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。探索柱層析技術(shù)從梓油中分離梓油四酯的最佳分離條件。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

烏桕梓油:湖北省大悟縣;柱層析硅膠:200～300目，青島海洋化工廠(chǎng);石油醚:60～90℃，AR，北京長(zhǎng)?；S(chǎng);乙酸乙酯:AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇:AR，浙江衢州巨化有限公司。

Agilent 7890A氣相色譜儀:美國(guó)安捷倫公司;Carry 50紫外 －可見(jiàn)分光光度計(jì)、Prostar 210高效液相色譜儀:美國(guó)瓦里安技術(shù)公司;層析柱:Φ13 mm×18 cm，自制;薄層色譜硅膠板:(Φ25 mm×75 mm)，青島海洋化工廠(chǎng)。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 烏桕梓油成分分析

梓油四酯因分子中含有2，4－癸二烯酸基團(tuán)，故在260 nm處具有紫外特征吸收［7］。

通過(guò)測(cè)定烏桕梓油的紫外光譜圖以及烏桕梓油的脂肪酸組成來(lái)判斷所購(gòu)烏桕梓油中是否含有梓油四酯。

1．2．1．1 烏桕梓油紫外光譜圖的測(cè)定

稱(chēng)取烏桕梓油17．5 mg，用乙醇溶解，配制成0．175 mg/mL的溶液，樣品溶液在200～800 nm之間掃描，得到烏桕梓油的紫外光譜圖。

1．2．1．2 烏桕梓油脂肪酸組成的測(cè)定

烏桕梓油的甲酯化:稱(chēng)取100 g烏桕梓油，30 g甲醇和1 g KOH，在恒溫水浴中加熱并恒溫在60℃，500 r/mim下攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后靜置分層取上層油相。上層油相經(jīng)酸洗、水洗、脫水后，取樣進(jìn)行GC－MS分析。

GC－MS分析條件:色譜條件:HP石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0．32 mm×0．50μm);載氣為高純氮?dú)?99．999%)，不分流進(jìn)樣;程序升溫:初始溫度80℃，以10℃/min升至260℃，維持10 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，EI電子能量70 eV，離子源溫度150℃，GC－MS傳輸線(xiàn)溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～650。

1．2．2 烏桕梓油中四酯含量測(cè)定

1．2．2．1 薄層層析定性測(cè)定烏桕四酯

烏桕梓油用石油醚溶解后，點(diǎn)樣于活化后的硅膠板底端，以石油醚∶乙酸乙酯=90∶10為展開(kāi)劑，展開(kāi)后的硅膠板在254 nm的紫外燈下觀(guān)察，標(biāo)示出熒光點(diǎn)后，將硅膠板放入碘量瓶中顯色，結(jié)果見(jiàn)圖2。烏桕梓油在硅膠板上呈現(xiàn)3個(gè)點(diǎn)，中間點(diǎn)在250 nm紫外燈下有熒光，初步確定為梓油四酯［8］。

圖2 烏桕梓油的TLC分析結(jié)果

1．2．2．2 HPLC定量測(cè)定烏桕四酯

色譜條件:色譜柱C18柱kromasil C18(250 mm×4．6 mm);檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;流動(dòng)相:乙腈∶異丙醇∶正己烷=80．5∶10∶9．5;流速:1 mL/min;柱溫30℃。

HPLC測(cè)定烏桕四酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):稱(chēng)取四酯標(biāo)樣0．135 1 g溶于正己烷中，定量至10 mL，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液。每次進(jìn)樣量分別為5、10、15、20μL。將每次得到的HPLC圖峰面積之和與進(jìn)樣的四酯質(zhì)量作圖，并擬合獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

樣品中四酯含量的確定:分別稱(chēng)取0．242 2 g梓油、0．143 6 g脫除四酯后的梓油、0．135 1 g梓油四酯溶于正己烷中，定量至25 mL，配成樣品溶液。樣品進(jìn)行HPLC分析，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中四酯的含量。

1．2．3 分離方法

1．2．3．1 洗脫液的確定

烏桕梓油用石油醚溶解后，點(diǎn)樣于活化后的硅膠板底端，分別在含石油醚50%、60%、70%、80%、90%、95%的石油醚與乙酸乙酯的混合溶液中展開(kāi)。展開(kāi)后的硅膠板置于碘量瓶中顯色。梓油在硅膠板上的條帶顯示，石油醚∶乙醚=95∶5的分離效果最好。故以石油醚∶乙醚=95∶5作為硅膠柱層析分離四酯的洗脫劑。

1．2．3．2 吸附劑的選擇

分別采用酸性氧化鋁和硅膠為吸附劑，用石油醚體積分?jǐn)?shù)為95%的石油醚與乙酸乙酯作為洗脫液，進(jìn)行柱層析分離四酯的試驗(yàn)。

1．2．3．3 柱層析法從烏桕梓油中分離烏桕四酯

將層析硅膠在105℃下活化2 h。在層析柱的底部放一石英棉，用石油醚濕法裝柱15 cm高(內(nèi)徑13 mm)，取0．606 0 g烏桕梓油，加2 mL石油醚溶解，緩緩倒入硅膠層析柱中，以石油醚和乙酸乙酯=95∶5作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，每5 mL收集一個(gè)餾分，得到24個(gè)餾分，用可見(jiàn)－紫外分光光度計(jì)檢測(cè)追蹤各洗脫組分的吸光度。組分濃度較大時(shí)，可進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋?zhuān)攸c(diǎn)收集在吸光度為260 nm有較大吸收時(shí)的組分，收集的餾分脫除溶劑后得到四酯樣品。

2 結(jié)果與討論

2．1 烏桕梓油組分的確定

烏桕梓油的紫外－可見(jiàn)光光譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 烏桕梓油的紫外－可見(jiàn)光光譜圖

從圖3可見(jiàn)，烏桕梓油在260 nm有特征吸收，這是由梓油四酯分子中2，4癸二烯酸基團(tuán)的共軛雙鍵引起的，與文獻(xiàn)［7］相符。說(shuō)明所用的梓油原料中含有梓油四酯。

2．2 烏桕梓油甲酯的GC－MS分析結(jié)果

烏桕梓油甲酯化產(chǎn)物經(jīng)GC－MS分析，其結(jié)果見(jiàn)圖4和表1。圖4為質(zhì)子離子流圖，表1為相應(yīng)出峰時(shí)間的MS分析結(jié)果。

?

梓油紫外光譜圖和梓油脂肪酸組成結(jié)構(gòu)顯示本試驗(yàn)所用的烏桕梓油中含有梓油四酯。

2．3 烏桕梓油中烏桕四酯含量的確定

以各梓油四酯的峰面積之和為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)作圖，通過(guò)線(xiàn)性擬合，得到HPLC分析烏桕梓油四酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=16．342X，式中:Y為四酯的進(jìn)樣量/μg，X為對(duì)應(yīng)的四酯峰面積之和。烏桕梓油四酯在67．55～270．2μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0．999 9。

HPLC測(cè)得梓油中甘油四酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41．7%。

2．4 HPLC分析結(jié)果

圖5給出了紫外吸收波長(zhǎng)260 nm處的梓油、梓油三酯、梓油四酯的HPLC色譜圖。該圖中的梓油三酯和梓油四酯分別是由梓油通過(guò)柱層析獲得的兩個(gè)產(chǎn)品(對(duì)應(yīng)于2．5部分的產(chǎn)品1和產(chǎn)品2)。圖5顯示，梓油和梓油四酯在260 nm下顯示有色譜峰，而梓油三酯卻沒(méi)有，這說(shuō)明組成梓油和梓油四酯的脂肪酸中含有2，4－癸二烯酸。四酯產(chǎn)品出現(xiàn)多個(gè)HPLC色譜峰是因?yàn)殍饔椭械乃孽ゲ皇菃我怀煞?，主要由OLnE、PLnE、OLE、PLE等具有不同脂肪酸組成的四酯組成。

圖5 梓油、三酯、四酯的HPLC圖

2．5 柱層析從烏桕梓油中分離四酯的結(jié)果

2．5．1 流出曲線(xiàn)

將硅膠柱層析試驗(yàn)所得各餾分進(jìn)行UV跟蹤分析，在波長(zhǎng)210、260 nm下進(jìn)行吸光度測(cè)量，以吸光度對(duì)各餾分對(duì)應(yīng)的洗脫體積作圖，得到硅膠柱層析分離梓油四酯的洗脫曲線(xiàn)，如圖6。

圖6顯示:在洗脫體積0～35 mL時(shí)，洗脫液在210 nm下有較大吸收，而在260 nm下吸光度很小，說(shuō)明該洗脫部分不含梓油四酯，因該洗脫部分的極性比四酯極性低，故推測(cè)為梓油三酯;在洗脫體積35～95 mL時(shí)，洗脫液在210 nm和260 nm下都有較大吸收，說(shuō)明該洗脫部分含有梓油四酯。洗脫體積大于95 mL，260 nm處的吸光度逐漸下降，而210 nm處仍有較大吸收，說(shuō)明梓油中含有極性高于四酯的其他成分。

圖6 硅膠柱層析分離梓油四酯的洗脫曲線(xiàn)

2．5．2 餾分的TLC結(jié)果

分別合并0～35 mL，35～95 mL和95 mL以后的洗脫液，脫除溶劑，得到產(chǎn)品1、2、3。

產(chǎn)品1，2，3用薄層層析分析組成，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 柱層析分離梓油四酯各產(chǎn)品的TLC圖譜

圖7顯示，產(chǎn)品1主要是梓油三酯，產(chǎn)品2主要是梓油四酯，產(chǎn)品3是極性比四酯高的成分和四酯的混合物。

2．5．3 HPLC分析結(jié)果

經(jīng)HPLC分析，柱層析得到的產(chǎn)品2中四酯含量為98%，同時(shí)計(jì)算得到四酯的收率為54．8%。

2．6 吸附劑種類(lèi)對(duì)柱層析法從梓油中分離甘油四酯效果的影響

分別探討了硅膠和活性氧化鋁作為吸附劑對(duì)柱層析法分離甘油四酯的效果的影響，將硅膠和活性氧化鋁作為吸附劑，柱層析后得到的餾出液進(jìn)行TLC分析，圖8為分析結(jié)果。

圖8 活性氧化鋁和硅膠作為吸附劑得到的產(chǎn)品的TLC圖譜

用活性氧化鋁作為吸附劑，獲得的各個(gè)餾分差異很小，基本上均含有梓油三酯和梓油四酯，三酯和四酯的分離效果很差。而硅膠作吸附劑獲得的前餾分主要含有梓油三酯，中間餾分主要是梓油四酯，后餾分是極性比四酯大的其他物質(zhì)。硅膠作為吸附劑，梓油四酯可以和三酯及其他物質(zhì)分開(kāi)，分離度較高，可以得到純度為98%的四酯產(chǎn)品。

烏桕梓油中甘油三酯和甘油四酯都具有不飽和雙鍵，硅膠是由于表面結(jié)構(gòu)中的硅羥基(—Si—OH)通過(guò)硅原子上的—OH與梓油中不飽和化合物形成氫鍵，但硅膠的吸附性能小于活性氧化鋁。在柱層析過(guò)程中選用吸附性能較小的硅膠吸附劑去分離中性的烏桕梓油的中的梓油四酯效果好于活性氧化鋁。

3 結(jié)論

3．1 烏桕梓油中含有41．7%四酯。

3．2 以硅膠為吸附劑，通過(guò)柱層析分離，得到收率為54．8%純度為98%的甘油四酯。

3．3 甘油四酯是一類(lèi)結(jié)構(gòu)特殊的甘油酯類(lèi)物質(zhì)，其分子中含有的8－羥基5，6－辛二烯酸和2，4癸二烯酸性質(zhì)活潑，是具有應(yīng)用前景的化工原料。從烏桕梓油中分離梓油四酯，有利于甘油四酯的應(yīng)用開(kāi)發(fā)。

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Separation and Identification of Tetracylglycerols from Stillingia Oil

Yin Lijun Lu Xianghong Lu Meizhen Xue Rong Dou Xiao Ji Jianbing
(Zhejiang Province Key Laboratory of Biofuel College of Chemical Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014)

Stillingia oil are extracted from the seeds of Sapoum sebifrrum Roxb．It contains a special structure of tetracylglycerols．Tetracylglycerols in stillingia oil is isolated using column chromatography．The UV spectrometry，Gas Chromatography(GC)，Gas Chromatography－Mass Spectrometry(GC－MS)and high performance liquid chromatography(HPLC)are used to analyze the separated samples．The result shows that the column chromatography is preferably conducted under such conditions:Silica gel as adsorbent，95%of petroleum ether and 5%ethyl acetate mixtures as eluent，flow rate of 1ml/min，m(stillingia oil):m(silica)=1∶17．The purity of 98%of stillingia oil samples is obtained and the yield is 54．8%under this condition．

tetracyglycerols，stillingia oil，column chromatography

TQ646．4

A

1003－0174(2012)08－0052－05

浙江省重大科技專(zhuān)項(xiàng)(2006C11015)

2011－11－03

尹立軍，男，1988年出生，碩士，化學(xué)工程

陸向紅，女，1971年出生，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，化學(xué)工程