香榧子油抗氧化活性及降血脂功能研究

徐 超 王鴻飛 邵興鋒 俞雯雯

香榧子油抗氧化活性及降血脂功能研究

徐 超 王鴻飛 邵興鋒 俞雯雯

(寧波大學生命科學與生物工程學院，寧波 315211)

通過測定香榧子油總抗氧化能力、清除O2·－、HO·和DPPH自由基能力評價其抗氧化活性;進行了香榧子油對小鼠血清中TG、TC、HDL－C和LDL－C影響的試驗，考察其降血脂功能。結果表明，香榧子油能有效地清除自由基，對O2·－、HO·和DPPH自由基的IC50分別為3．16、4．20和9．20 mg/mL;與高脂模型組相比，香榧子油劑量組TG、TC和LDL－C水平顯著降低(P＜0．01或P＜0．05)，HDL－C水平顯著升高(P＜0．05)。香榧子油具有一定的抗氧化能力，對改善血脂水平有顯著的作用。

香榧子油 抗氧化 自由基 降血脂

香榧(Torreya grandis cv．merrillii)又稱榧子、真榧、玉山果、細榧等，為紅豆杉科榧屬常綠喬木，是我國特有的珍稀樹種，主要分布在我國浙江、江蘇、安徽、福建等省份的丘陵地區(qū)，其中浙江省諸暨市的香榧年產(chǎn)量占全國一半以上［1－2］。其果實俗稱香榧子，是世界珍貴稀有干果之一，炒熟后香酥甘醇，品質甚佳，營養(yǎng)豐富;還具有很高的藥用價值，《本草從新》認為香榧“治肺火，健脾士，補氣化痰，止咳嗽，定咳喘，去瘀生新”［3］。

目前，對香榧子油的研究主要集中在測定營養(yǎng)成分、脂肪酸含量及組成上，在特性及功能性評價等方面的報道相對較少。本試驗對超臨界CO2萃取的香榧子油進行了體外抗氧化活性研究，同時在建立小鼠高脂血癥模型的基礎上，以香榧子油進行干預，研究其對試驗性高脂血癥小鼠血脂水平的影響，為香榧子油進一步開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料和試劑

香榧子:浙江省諸暨市楓橋鎮(zhèn);ICR小鼠:浙江省實驗動物中心。

三吡啶三吖嗪(TPTZ，分析純):sigma－Aldrich公司;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH，分析純):和光純藥工業(yè)股份公司;鄰菲啰啉(分析純):中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司;鄰苯三酚(分析純):國藥集團化學試劑有限公司;豬油:市售板油熬制;膽固醇:上?；菔郎噭┯邢薰?甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)試劑盒:濰坊市康華生物技術有限公司。

1．2 儀器與設備

Spe－ed SFE型超臨界萃取儀:美國Applied Separations公司;Agilent 7890A型氣相色譜儀:美國安捷倫公司;WK－200B型高速藥物粉碎機:山東青州市精誠機械有限公司;H1650型高速臺式離心機:長沙湘儀離心機設備有限公司;EL204型電子天平:梅特勒－托利多儀器上海有限公司;UNIC7200型可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司;DKS22型電熱恒溫水浴鍋:上海精密實驗設備有限公司。

1．3 方法

1．3．1 香榧子油的提取

將香榧子核仁粉碎，過40目篩，105℃干燥3 h，稱取適量粉末裝入超臨界CO2萃取儀的萃取釜中，設定適宜提取工藝參數(shù):萃取時間4 h，萃取壓力45 MPa，萃取溫度50℃。

香榧子油脂肪酸甲酯制備參考文獻［4］。

香榧子油脂肪酸組成及成分鑒定GC條件參考文獻［5］。

1．3．2 香榧子油體外抗氧化活性研究

1．3．2．1 總抗氧化活性的測定——FRAP法［6－7］

FRAP法原理為:Fe3+－TPTZ可被樣品中還原物質還原為Fe2+－TPTZ形式并呈現(xiàn)出明顯的藍色，于593 nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度的大小計算樣品抗氧化能力的強弱。一般情況下，物質的還原能力越強，其抗氧化活性也越高。

TPTZ工作液的配制:0．2 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH 3．6)、10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L鹽酸)、20 mmol/L FeCl33者的比例為10∶1∶1。

還原力標準曲線的繪制:取不同體積的1 mmol/L FeSO4溶液，用蒸餾水補至2 mL，再加入3 mL TPTZ工作液，混勻后于37℃反應10 min，593 nm處測定吸光度，制定還原力標準曲線。

香榧子油總抗氧化活性測定:在試管中加入一定質量濃度的香榧子油乙醇溶液2 mL，再加入3 mL TPTZ工作液，混勻后于37℃反應10 min，593 nm處測定吸光度，平行測定3次，取平均值?？寡趸芰σ韵嗤舛戎档腇eSO4當量濃度表示，記為FRAP值。同時以VC作為對照。

1．3．2．2 清除超氧陰離子自由基的能力測定——鄰苯三酚自氧化法［8－9］

鄰苯三酚在自氧化過程中伴有O2·－生成，在pH＜9．0時，自氧化速率與生成的O2·－濃度呈正相關，通過吸光度的變化測定抗氧化劑對O2·－的清除能力，間接評價其抗氧化能力。

鄰苯三酚自氧化速率測定:在試管中加入4．5 mL 50 mmol/L Tris－HCl緩 沖 液(pH 8．2)和1．0 mL蒸餾水，混勻于37℃水浴中保溫20 min后取出，立即加入已在37℃預熱的3 mmol/L鄰苯三酚0．5 mL，迅速搖勻倒入比色皿中，以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作對照，325 nm處每隔30 s測定其吸光度。以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標線性回歸，其斜率為鄰苯三酚自氧化的反應速率(Vblank)。

香榧子油對鄰苯三酚自氧化速率的影響:按上述步驟，在加入鄰苯三酚前先分別加入1 mL不同質量濃度的香榧子油乙醇溶液。同樣以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作對照，測定吸光度，每個樣品平行測定3次，取其平均值。按相同的方法進行線性回歸，曲線斜率記為Vsample。

1．3．2．3 清除羥基自由基的能力測定［10］

Fenton反應是生物體內(nèi)產(chǎn)生·OH的主要來源，參照Fenton反應的方法建立反應體系。反應體系所需溶液及試劑為:PBS緩沖液(pH 7．4)、0．75 mmol/L鄰菲鄰菲啰啉無水乙醇、0．75 mmol/L FeSO4溶液、雙氧水(0．01%)，不同質量濃度香榧子油乙醇溶液(表1)。

表1 各溶液加入反應體系體積

反應體系置于37℃恒溫水浴中反應1 h后立即取出并迅速測定其在536 nm處的吸光度，平行測定3次，取平均值。

1．3．2．4 清除DPPH自由基的能力測定［11］

利用DPPH溶液的特征紫色團在517 nm處有最大光吸收，通過加入抗氧化劑后吸光度值的變化評價其清除自由基的強弱。在試管中加入不同質量濃度的香榧子油乙醇溶液及等體積的0．2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后于暗處靜置30 min，以無水乙醇為參比，517 nm下測定其吸光度值，平行測定3次，取平均值。

注:A0為2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇;A1為2 mL DPPH溶液+2 mL香榧子油乙醇溶液;A2為2 mL無水乙醇+2 mL香榧子油乙醇溶液。

1．3．3 香榧子油降血脂功能研究

1．3．3．1 試驗動物

ICR小鼠體重在20 g左右，共50只，雌雄參半，由浙江省實驗動物中心提供。

1．3．3．2 動物飼料

高脂飼料:基礎飼料500 g，豬油90 g，膽固醇9 g，膽酸鹽0．9 g，丙基硫氧嘧啶0．9 g，水300 mL。

1．3．3．3 分組設計

ICR小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為5組，即正常對照組、高脂模型組、高、中、低劑量組，每組10只，試驗期為28 d，除正常對照組飼以基礎飼料外，其余各組飼以高脂飼料，均自由進食和飲水。

正常對照組和高脂模型組:每天2 mL生理鹽水灌胃;高劑量組:11 mL/(kg·d)樣品灌胃，相當于人體推薦量的20倍;中劑量組:5 mL/(kg·d)樣品灌胃，相當于人體推薦量的10倍;低劑量組:2．75 mL/(kg·d)樣品灌胃，相當于人體推薦量的5倍。飼養(yǎng)結束后，禁食12 h，次日清晨眼眶取血，3 500 r/min離心20 min分離血清，按試劑盒說明測定血清各項指標［12－13］。

1．3．3．4 統(tǒng)計分析

采用SPSS17．0軟件，結果以珔X±s表示，對數(shù)據(jù)進行t檢驗，進行方差分析及均數(shù)兩兩比較。

2 結果與分析

2．1 香榧子油的提取

利用超臨界CO2萃取儀提取的香榧子油得率為94．57%，GC分析香榧子油脂肪酸組成結果表明，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的87．28%，其中亞油酸、油酸和二十碳三烯酸質量分數(shù)分別為42．02%、32．14%和9．80%。

2．2 香榧子油體外抗氧化活性測定

2．2．1 總抗氧化能力

按照1．3．2．1的方法進行試驗，得總抗氧化能力測定標準曲線，如圖1所示。

圖1 總抗氧化測定標準曲線

由圖1可以看出，F(xiàn)eSO4濃度在0～1 mmol/mL范圍內(nèi)與吸光度值成良好線性關系。擬合方程:y=0．882 2x+0．031 6，相關系數(shù)R2=0．995 0。因此，以593 nm處的吸光度值換算成樣品的FeSO4當量濃度的方法是可行的。

取不同質量濃度的香榧子油乙醇溶液和VC進行總抗氧化活性測定，結果如圖2所示。

圖2 總抗氧化能力

由圖2可以看出，香榧子油總抗氧化活性隨濃度的增大而提高，但弱于相同濃度下強抗氧化劑VC的總抗氧化能力。抗氧化活性反映的不是樣品針對某一種自由基的清除活性，而是樣品總還原能力［14］。

2．2．2 清除超氧陰離子自由基的能力

隨著樣品濃度的增加，其在325 nm處的OD值也增加，從而影響圖的直觀性。將第1分鐘的OD值作為空白，用2～6 min時的OD值減去它，得到ΔA。按上述方法測定OD值，作ΔA－t的關系圖3，可以直觀地比較樣品清除超氧陰離子自由基的強弱［9］。

圖3 香榧子油對鄰苯三酚吸光度的影響

由圖3可以看出，反應體系OD值隨時間的延長而變大;隨著加入香榧子油濃度的增大反應體系OD值增長逐漸變緩。

按公式(1)計算不同質量濃度香榧子油對鄰苯三酚自氧化抑制率，作濃度與抑制率關系圖4。

圖4 香榧子油清除超氧陰離子自由基活性

由圖4可以看出，香榧子油對O2·－自由基的清除能力隨濃度的增加而加強，當香榧子油質量濃度為5 mg/mL時，清除率達到57．51%，表明香榧子油對O2·－自由基具有一定的清除作用。根據(jù)擬合曲線計算香榧子油清除O2·－自由基的IC50為4．20 mg/mL。

2．2．3 清除羥基自由基的能力

按公式(2)計算不同質量濃度的香榧子油對HO·清除率，結果如表2所示。

表2 香榧子油對·OH清除率的影響

由表2可以看出，香榧子油對·OH清除率隨著濃度的增加而升高，當質量濃度為4 mg/mL時，清除率達到65．22%。依據(jù)清除率曲線計算香榧子油對·OH的IC50為3．16 mg/mL。

2．2．4 清除DPPH自由基的能力

按1．3．2．4方法進行試驗，由公式(3)計算不同質量濃度香榧子油對DPPH自由基的清除率，如表3所示。

表3 香榧子油對DPPH自由基清除率的影響

由表3可以看出，清除率隨濃度的增加而升高;根據(jù)清除率曲線計算香榧子油清除DPPH自由基的IC50為9．20 mg/mL。

2．3 香榧子油降血脂的作用

香榧子油對小鼠血脂水平的影響見表4。

表4 香榧子油對血脂水平的影響(珔X±s，mmol/L，n=10)

由表4可以看出，與正常對照組相比，高脂模型組TG、TC和LDL－C水平顯著升高(P＜0．01)，HDL－C水平顯著降低(P＜0．05)，表明飼以高脂飼料造成了小鼠的高脂血癥模型。與高脂模型組相比，高劑量組血清TC、LDL－C水平(P＜0．05)和TG水平(P＜0．01)顯著降低，HDL－C水平顯著升高(P＜0．05);中劑量組血清TG和LDL－C水平顯著降低(P＜0．05)，HDL－C水平顯著升高(P＜0．05)，TC水平雖有降低，但無顯著變化(P＞0．05);低劑量組血清TG、TC和LDL－C水平降低，HDL－C水平升高，但無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。表明香榧子油能干預試驗性高脂血癥小鼠血脂水平的升高，具有一定的防治作用。

3 討論與結論

香榧子油不飽和脂肪酸占總脂肪酸的87．28%，其中亞油酸、油酸和二十碳三烯酸質量分數(shù)分別為42．02%、32．14%和9．80%。不飽和脂肪酸是人體生命活動必不可少的重要物質，具有調(diào)節(jié)血脂水平、清除體內(nèi)自由基、軟化血管、延緩衰老等作用［15］。

通過對總抗氧化活性、清除超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基的研究試驗，表明香榧子油具有一定的抗氧化活性;對羥基自由基的清除能力強于超氧陰離子自由基，DPPH自由基次之，IC50分別為3．16、4．20和9．20 mg/mL。

通過對小鼠血脂水平的影響結果可以看出，與高脂模型組相比，香榧子油劑量組TG、TC和LDL－C水平顯著降低(P＜0．01或P＜0．05)，HDL－C水平顯著升高(P＜0．05)，并呈現(xiàn)一定的量效關系，表明香榧子油具有改善血脂水平的功能，其調(diào)節(jié)血脂水平的作用機制可能與亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸油有關，大量研究表明油酸和亞油酸對心腦血管疾病有防治作用［16］，Spady［17］以高脂血癥大鼠為研究對象，結果表明亞油酸可顯著降低血清TG和TC含量;Laaksonen等［18］研究表明亞油酸和n－3多不飽和脂肪酸在防治心腦血管疾病上具有協(xié)同增效作用。

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Study on Antioxidant Activity and Reducing Blood Fat Function of Kaga Oil

Xu Chao Wang Hongfei Shao Xingfeng Yu Wenwen
(Institute of Life Science and Biotechnology，Ningbo University，Ningbo 315211)

This article sudies the antioxidant activity of kaga oil by supercritical CO2extraction and reducing blood fat function．The antioxidant activity of TGO is evaluated based on total antioxidant power，O2·－，HO·and DPPH free radical scavenging activities．It also experiments the kaga oil's influences to TG、TC、HDL－C and LDL－Cof mouth's blood and investigates the function of reducing blood fat．The result shows that kaga oil can eliminate radicals effectively and the IC50values of O2·－，HO·and DPPH radicals sre 3．16 mg/mL，4．20 mg/mL and 9．20 mg/mL respectively．Compared with high fat model groups，the contents of TG，TC and LDL －C are significantly reduced(P＜0．01 or P＜0．05)，but the HDL －Cis significantly increased(P＜0．05)．Kaga oil has some kind of antioxidant activities and significant reducing blood fat functions．

kaga oil，antioxidant activity，free radical，reducing blood fat

TS229 文獻標示碼:A

1003－0174(2012)08－0043－05

寧波大學人才基金(2006244)

2011－10－31

徐超，男，1988年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工

王鴻飛，男，1964年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工，食品科學