牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

陳其兵，薛 霜，漆世華，朱 薇，張 萍，謝紅玲，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea，BVD)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的牛羊傳染病，其病原為黃病毒科瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)。BVDV 是危害養(yǎng)牛業(yè)、養(yǎng)羊業(yè)和養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，能引起感染動物產(chǎn)生以腹瀉為主的一系列復(fù)雜的臨床癥狀[1-3]。BVDV 感染可發(fā)生于子宮內(nèi)[4]，垂直感染使得胎牛血清、豬瘟細(xì)胞疫苗等很難控制BVDV污染，給畜牧業(yè)及相關(guān)生物制品領(lǐng)域造成了重大經(jīng)濟損失。

檢測BVDV的方法很多，主要包括血清學(xué)中和試驗、細(xì)胞分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、PCR技術(shù)等。血清學(xué)方法多存在費時、費力、準(zhǔn)確率低等缺點。我國診斷BVDV國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)采用培養(yǎng)細(xì)胞分離病毒的方法，但該方法費時費力，加之病毒分離率低，有些非致細(xì)胞病變型BVDV在細(xì)胞培養(yǎng)中不出現(xiàn)細(xì)胞病變，因而不利于大規(guī)模應(yīng)用檢測[5-6]。近幾年發(fā)展起來的實時熒光定量PCR技術(shù)將傳統(tǒng)PCR與熒光檢測方法相結(jié)合，具有操作簡便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為病原檢測的重要方法。本研究建立了一種特異性的BVDV熒光定量RT-PCR快速檢測方法，可用于BVDV的臨床輔助診斷、快速定量檢測以及對生物制品中是否污染BVDV進行監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒、豬瘟疫苗毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、MDBK細(xì)胞、胎牛血清由武漢中博生物股份有限公司保存，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司。

1.1.2 主要試劑 BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor、DNaseⅠ、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 片段回收純化試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖小⒉《竞怂崽崛≡噭┖?、熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法)均購自大連寶生物工程有限公司，pEASY-T1克隆載體購自北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計 通過分析BVDV的保守基因片段，并結(jié)合熒光PCR引物探針設(shè)計特點，利用DNAStar軟件進行同源性排序分析比較，選出在BVDV 5’UTR序列中種內(nèi)保守種間特異的核苷酸片段，然后利用Primer Express及DNAStar軟件設(shè)計篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針。

1.2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.2.1 體外轉(zhuǎn)錄模板的制備 以提取的BVDV核酸為模板擴增目的基因片段，經(jīng)回收純化后將其連接至pEASY-T1載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過抗性篩選、擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將經(jīng)PCR初步鑒定為陽性的質(zhì)粒送生物公司測序鑒定并及時保存陽性菌液和質(zhì)粒。

1.2.2.2 體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)品 將構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切使質(zhì)粒線性化，T7 RNA聚合酶37℃體外轉(zhuǎn)錄2 h，DNaseⅠ消化去除模板 DNA，酚/氯仿/異戊醇抽提純化RNA，置于-70℃保存?zhèn)溆?。?jīng)紫外分光光度計測定含量(連續(xù)測定5次取平均值)，計算出每微升所含的拷貝數(shù)并進行10倍梯度稀釋，作為定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

1.2.3.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)寶生物One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書，用所制備的標(biāo)準(zhǔn)品對PCR反應(yīng)條件和體系進行優(yōu)化。

1.2.3.2 特異性實驗 在相同的條件下，同時對未接毒的MDBK細(xì)胞、牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒、豬瘟疫苗毒和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒提取核酸。應(yīng)用優(yōu)化后的PCR體系及條件對上述樣品進行檢測，同時以定量標(biāo)準(zhǔn)品和無菌水分別作為陽性和陰性對照，驗證所建立檢測方法的特異性。

1.2.3.3 敏感性試驗 以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進行RT-PCR，得到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢出量。

1.2.3.4 重復(fù)性試驗 用所建立的方法對3組不同病毒含量的樣品進行重復(fù)性測定，所得檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后，計算組內(nèi)的變異系數(shù)(CV)。

1.3 臨床樣品的檢測 用所建立的方法對10份胎牛血清樣品和10份豬瘟細(xì)胞苗半成品進行檢測，同時設(shè)立陰、陽性對照，計算陽性檢出率。

2 實驗結(jié)果

2.1 引物、探針設(shè)計 通過分析BVDV-Ⅰ型的保守基因片段，并結(jié)合熒光PCR引物探針設(shè)計特點，利用DNAStar軟件進行同源性排序分析比較，選出在5’UTR序列中種內(nèi)保守種間特異的核苷酸片段，然后利用Primer Express及DNAStar軟件設(shè)計篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針(表1)。

表1 BVDV熒光定量RT-PCR引物和探針

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化 經(jīng)相關(guān)實驗優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:2×One Step RT-PCR BufferⅢ10 μL、10 μM TaqMan 探針 0.4 μL、10 μM 上游引物 0.4 μL、10 μM 下游引物 0.4 μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL、Prime-Script RT Enzyme MixⅡ 0.4 μL、Rox Reference Dye 0.4 μL、DEPC H2O 5.6 μL、模板 2 μL。

擴增條件為:42℃ 5 min，95℃ 10 s，1個循環(huán);95℃ 5 s，60℃ 40 s(收集熒光FAM)，40個循環(huán)。

2.3 特異性試驗 結(jié)果顯示，牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒和陽性對照品檢測結(jié)果為陽性，而豬瘟細(xì)胞毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、MDBK細(xì)胞和陰性對照品均為陰性(圖1)。證明所建立的方法能特異性的檢測出牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒。

圖1 特異性試驗結(jié)果

2.4 敏感性試驗 以十倍系列稀釋的BVDV轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品(2.15×102～2.15×108拷貝/μL)作為模板進行檢測，結(jié)果顯示，在2.15×102～2.15×108拷貝/μL的范圍內(nèi)可以得到良好的動力學(xué)曲線(圖2)且標(biāo)準(zhǔn)曲線較為理想(圖3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)在0.99以上，提示誤差較小，可信度較高。說明本方法可檢測低至103～104拷貝/mL的病毒量。

2.5 重復(fù)性試驗 所得檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后，計算組內(nèi)的變異系數(shù)(CV)，結(jié)果顯示CV值均小于3%，說明差異不顯著，該檢測方法重復(fù)性較好(表2)。

表2 樣品組間重復(fù)性檢測

2.6 臨床樣品的檢測 在所檢測20份樣品中，其中胎牛血清樣品BVDV陽性4份(4/10)，豬瘟細(xì)胞苗半成品BVDV陽性2份(2/10)。陽性檢出率為30%，且陰、陽性對照均成立，檢測結(jié)果見圖4。

圖4 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

牛病毒性腹瀉病至今仍是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的傳染病，世界各國對該病都十分重視，對其展開的研究力度逐年都在增加，近幾年來我國牛感染BVDV并持續(xù)帶毒的現(xiàn)象時有發(fā)生[7]。由于BVDV與豬瘟病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員，具有較近的親緣關(guān)系，兩者的氨基酸同源性約為85%[8]，在血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)，因而血清學(xué)方法難以區(qū)分BVDV和CSFV。在生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的過程中會用到胎牛血清、牛睪丸細(xì)胞等牛源制品，一旦這些制品中污染了BVDV，便會造成豬瘟細(xì)胞疫苗的污染。據(jù)相關(guān)報道，豬使用污染了BVDV的豬瘟疫苗后可感染BVDV，出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。另外，用含BVDV抗原和抗體的牛血清也會干擾豬瘟病毒的體外培養(yǎng)[9]。因而建立特異敏感的BVDV檢測方法，有利于保障牛血清、豬瘟細(xì)胞活疫苗等的質(zhì)量。

目前BVDV的診斷技術(shù)研究水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他方面的研究進展，如何建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法是當(dāng)前BVDV防制工作的迫切要求。實時定量PCR方法操作簡便、快速高效、具有較高的敏感度和特異性，而且封閉性好、不需要后續(xù)處理，大大降低了污染的可能性。顯著的優(yōu)越性使得該方法不僅在生物技術(shù)方面應(yīng)用廣泛，現(xiàn)今更作為一種診斷方法應(yīng)用于臨床。本研究建立了一種能夠快速、特異、靈敏的檢測BVDV的熒光定量RT-PCR方法，通過對20份胎牛血清和豬瘟細(xì)胞疫苗樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中6份樣品污染了BVDV(6/20)。實驗證實所建立的檢測方法簡便、快捷，具有較好的特異性、敏感性且重復(fù)性好。可用于臨床及科研中對BVDV的快速定量檢測和對牛血清及豬瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染BVDV進行監(jiān)測。但本研究中的引物和探針序列是根據(jù)BVDV-Ⅰ型設(shè)計的，豬瘟疫苗中是否有BVDV-Ⅱ型毒株的污染尚需用多種方法進一步檢測才能確定。

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