轉(zhuǎn)化生長因子-β1在多柔比星致大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的促進(jìn)作用

陳星，潘建業(yè)，周艷芳，王好，顧琳，張國輝

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002)

蒽環(huán)類藥物多柔比星(doxorubicin，DOX)作為化療藥物已廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療，但同時也會引起人體嚴(yán)重的并發(fā)癥，其中以心臟毒性最具代表性，臨床上主要表現(xiàn)為心肌病的慢性發(fā)展，最終可導(dǎo)致心力衰竭［1］，這一過程被認(rèn)為是多因素共同作用的結(jié)果，主要包括活性氧自由基增多、脂質(zhì)過氧化、鈣超載、細(xì)胞凋亡、能量代謝紊亂等［2］。在心衰的發(fā)展過程中有多種細(xì)胞因子參與調(diào)控，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作為多效性細(xì)胞因子，能夠抑制炎癥、促進(jìn)血管新生，但同時也會引起心肌細(xì)胞肥大、凋亡及纖維化等［3］。本研究觀察不同濃度多柔比星作用于大鼠心肌細(xì)胞不同時間后，心肌細(xì)胞的存活率和凋亡率的改變以及TGF-β1表達(dá)量的差異，探討 TGF-β1在多柔比星心臟損傷過程中是否具有促進(jìn)作用。

1 材料和方法

1.1 動物和主要試劑

新生SD大鼠，1～2日齡，雌雄不限，由江蘇大學(xué)動物實驗中心提供。

鹽酸多柔比星購自美國Enzo公司，DMEM-F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，標(biāo)準(zhǔn)小牛血清購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司，多聚賴氨酸購自碧云天生物科技公司，α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomericactin，α-SA)、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)、AnnexinⅤ/PI雙染凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司，TGF-β1ELISA試劑盒購自R＆D公司。其余生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞分離及培養(yǎng) 新生SD大鼠經(jīng)75%乙醇消毒2次，無菌條件下取出心臟，將其剪成1 mm左右的組織塊，用PBS清洗組織塊2遍。用0.06%胰酶和0.1%Ⅰ型膠原酶共同消化，收集消化后的上清并用含20%血清的DMEM-F12中和，直到組織塊變透明終止消化。將收集的細(xì)胞離心、重懸，差速貼壁1.5 h，后將純化的心肌細(xì)胞按所需密度接種于不同的細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后用含10%小牛血清的DMEM-F12更換培養(yǎng)液。

1.2.2 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)1～3 d的心肌細(xì)胞形態(tài)及搏動情況。取培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞進(jìn)行α-SA鑒定，α-SA陽性率作為心肌細(xì)胞純度鑒定的指標(biāo)。400倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，每個視野計數(shù)20～30個細(xì)胞，計算α-SA陽性細(xì)胞比例。

1.2.3 MTT法檢測心肌細(xì)胞存活率 心肌細(xì)胞按密度1×105/ml接種于96孔板培養(yǎng)3 d，分別加入終濃度為 0.5，1，2 μmol/L 的多柔比星，各濃度組又分4，12，24，48，72 h 時間點進(jìn)行檢測，以不加多柔比星培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。以空白孔調(diào)零。各孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，37℃孵育4 h后，吸出每孔上清，再各加入200 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀(490 nm)檢測各孔光密度(D)值。心肌細(xì)胞存活率=(多柔比星組D值-空白孔D值)/(對照組D值-空白孔D值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ/PI雙染法檢測凋亡率 心肌細(xì)胞按密度1×106/ml培養(yǎng)，分為對照組和多柔比星組，多柔比星組以2 μmol/L多柔比星處理心肌細(xì)胞，4，12，24，48，72 h 后進(jìn)行檢測。接種于培養(yǎng)板中的各組細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次;各組分別加入結(jié)合緩沖液(binding buffer)500 μl混勻懸浮細(xì)胞，加入 5 μl FITC標(biāo)記的膜結(jié)合蛋白V(Annexin V-FITC)避光反應(yīng)，再加入10 μl碘化丙啶(PI)避光4℃孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測分析。以AnnexinⅤ(+)/PI(-)、AnnexinⅤ(+)/PI(+)兩個象限的細(xì)胞比例之和作為凋亡率。

1.2.5 ELISA 檢測各組心肌細(xì)胞上清中 TGF-β1含量 心肌細(xì)胞按3×105/ml接種24孔板培養(yǎng)。收集各組細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒操作，酶標(biāo)儀(450 nm)檢測各孔光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細(xì)胞上清中TGF-β1濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，重復(fù)測量資料采用一般線性模型方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代分離及純化后的心肌細(xì)胞，培養(yǎng)1 d能夠貼壁，一部分細(xì)胞有微弱的自發(fā)搏動，頻率為30～40次/min;培養(yǎng)2 d的心肌細(xì)胞逐漸伸出偽足，由圓形變?yōu)樗笮?培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞呈星形、三角形及不規(guī)則形，呈團(tuán)簇狀生長，匯合后出現(xiàn)同步搏動，頻率為50～60次/min。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×400)Fig 1 The cultured cardiomyocytes isolated from 1～2 d SD rats(×400)

2.2 心肌細(xì)胞的純度鑒定

培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞α-SA鑒定，心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色，即表達(dá)為陽性，非心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)陰性，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞純度可達(dá)90%。見圖2。

圖2 α-SA免疫化學(xué)染色鑒定原代心肌細(xì)胞純度(×400)Fig 2 The purify of cardiomyocytes was evaluated by immunocytochemical staining with α-SA(×400)

2.3 多柔比星不同濃度及不同處理時間對心肌細(xì)胞存活率的影響

在每個時間點，不同濃度多柔比星處理后的心肌細(xì)胞與對照組相比，隨著多柔比星濃度的增加，心肌細(xì)胞存活率隨之下降，呈劑量依賴性(P＜0.05);其中，2 μmol/L 組較0.5 μmol/L 組和1 μmol/L 組心肌細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.01)。同一濃度不同時間點之間兩兩比較，除0.5 μmol/L濃度組48 h和72 h間心肌細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 多柔比星不同濃度及不同處理時間對心肌細(xì)胞存活率的影響(±s，n=3)Fig 3 The survival rates of cardiomyocytes induced by different concertrations and different times of DOX

2.4 多柔比星對心肌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析表明，對照組心肌細(xì)胞凋亡率為(1.39 ±0.18)%，而2 μmol/L 多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞4 h后，其凋亡率為(3.65±0.49)%，較對照組增加(P＜0.05);隨著處理時間延長，心肌細(xì)胞凋亡率逐漸增加，12，24，48，72 h 的凋亡率分別為(8.54±0.64)%，(11.70 ±1.62)%，(17.67 ±1.48)%，(17.80 ±1.67)%，呈時間依賴性(F=103.80，P ＜0.05)，其中，48 h組和72 h組之間凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖4。

2.5 多柔比星對心肌細(xì)胞分泌TGF-β1的影響

2 μmol/L多柔比星處理心肌細(xì)胞不同時間后，12 h、24 h、48 h 細(xì)胞上清中 TGF-β1蛋白濃度較對照組明顯增加，72 h 較 24 h，48 h TGF-β1分泌量下降(P＜0.05)，見圖 5。同時，多柔比星誘導(dǎo) 4～48 h后，其所分泌的TGF-β1與心肌細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，r=0.932。

3 討論

蒽環(huán)類抗生素多柔比星作為化療藥物已廣泛用于治療各種腫瘤疾病。然而研究發(fā)現(xiàn)，多柔比星治療的腫瘤患者，其心臟疾病發(fā)生率呈劑量依賴性，當(dāng)累積藥量達(dá)到550 mg/m2時，心臟疾病發(fā)生率可達(dá)7%［4］。多柔比星心臟毒性臨床上主要表現(xiàn)為慢性心肌病過程，嚴(yán)重者可發(fā)展為伴有充血性心力衰竭的擴(kuò)張型心肌?。?］。研究者們希望在不降低多柔比星抗腫瘤特性的同時，減少心臟毒性的發(fā)生。目前，對于多柔比星心臟毒性的機(jī)制仍不明確，普遍認(rèn)為，活性氧自由基(ROS)生成、脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷、鈣超載、Fe2+-DOX復(fù)合物引起的氧化應(yīng)激是其中重要環(huán)節(jié)。隨著研究深入，多柔比星導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子及特異性基因異常表達(dá)、代謝產(chǎn)物阿霉素醇(DOXol)異常蓄積逐漸成為新的研究熱點［2］。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞的凋亡率Fig 4 The apoptosis rate was determined by flow cytometry(FCM)

圖5 多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞不同時間TGF-β1蛋白表達(dá)量Fig 5 The protein levels of TGF-β1of cardiomyocytes treated by 2 μmol/L DOX with different times

多柔比星引起的心肌細(xì)胞凋亡是心肌病呈慢性發(fā)展，并且最終導(dǎo)致心力衰竭的關(guān)鍵。心肌細(xì)胞線粒體損傷是多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的前兆，表現(xiàn)為線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡化，并能釋放一系列可溶性促凋亡蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，如細(xì)胞色素C、AIF、Smac等，這一機(jī)制本課題組已有前期研究［5］。研究還發(fā)現(xiàn)，除內(nèi)在線粒體介導(dǎo)凋亡，多柔比星可以通過激活p38 MAPK途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能與氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS蓄積有關(guān)［6］。同時，p38 MAPK信號通路又能調(diào)節(jié)各種促凋亡細(xì)胞因子表達(dá)，包括TNF-α、IL-1β、TGF-β 等［7］。

然而，多柔比星是否可以通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自身分泌TGF-β來誘導(dǎo)凋亡尚未見報道。在心衰發(fā)展過程中，心臟由代償轉(zhuǎn)向失代償，心肌細(xì)胞或非心肌細(xì)胞自身都能產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，通過自分泌或旁分泌，在特定的條件下，經(jīng)特定的信號級聯(lián)通路，調(diào)控心衰的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β是在心力衰竭過程中急劇增加的細(xì)胞因子中的一員［8］。TGF-β1作為TGF-β超家族中的重要亞型，生物學(xué)功能最復(fù)雜，對其研究也最多［3］。TGF-β1在介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中，主要依賴 SMAD信號通路［9］。Schr?der等［10］發(fā)現(xiàn) AngⅡ通過 p38 MAPK 通路激活GATA和AP-1(轉(zhuǎn)錄激活因子)，使大鼠心肌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)上調(diào)，而分泌的 TGF-β1又可以作用于心肌細(xì)胞自身，通過激活SMAD信號通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡;Heger等［11］發(fā)現(xiàn) TGF-β1可激活 SMAD4 蛋白，SMAD4又可誘發(fā)心肌細(xì)胞由肥大向凋亡轉(zhuǎn)變。在大鼠心肌梗死模型中，內(nèi)皮氧化亞氮合酶(eNOS)能下調(diào)Caspase-3、TGF-β1蛋白水平，而在eNOS抑制劑LNAME的作用下，其抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用減弱，這與抑制 TGF-β1/Smad2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)［12］。研究者們還發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)張型心肌病患者心肌組織中TGF-β1表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)量高低與患者預(yù)后密切相關(guān)［13］。

本實驗通過體外培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)多柔比星在0.5～2 μmol/L濃度范圍內(nèi)均可使心肌細(xì)胞存活率下降，呈濃度依賴性，且2 μmol/L多柔比星可使細(xì)胞存活率顯著下降;多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞4～72 h，細(xì)胞存活率呈時間依賴性下降，且4 h即可出現(xiàn)顯著下降。

在成功建立多柔比星體外心肌細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上，用2 μmol/L多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞不同時間，4～48 h內(nèi)可使細(xì)胞凋亡率隨時間延長而顯著增加，同時細(xì)胞自身能夠不斷分泌TGF-β1且分泌量不斷增加，與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，而72 h后TGF-β1分泌量逐漸下降，我們推測這可能與大量心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及部分壞死后正常分泌功能受損，以及TGF-β1分泌后降解以致檢測濃度下降有關(guān)。

綜上所述，采用2 μmol/L多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞4 h即可建立體外心肌細(xì)胞損傷模型，在誘導(dǎo)凋亡的同時，心肌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)量逐漸增加，與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，提示在多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞時，可以通過自分泌TGF-β1促使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能是多柔比星心臟毒性引起心力衰竭的重要機(jī)制之一。

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