鱖魚肌球蛋白重鏈基因的原核表達及多克隆抗體的制備

劉希良，王開卓，成 嘉，蒙 濤，陳敦學(xué)，李玉瓏，張紅芳，張建社，褚武英

(1.長沙大學(xué)生物工程與環(huán)境科學(xué)系，中國 長沙 410003；2. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 桂林 541004；3.九江學(xué)院 生命科學(xué)系，中國 九江 332005)

肌球蛋白是肌肉主要構(gòu)成蛋白質(zhì)之一．它由Kuhne于1859年首先報道，之后于1864年在研究骨骼肌收縮時發(fā)現(xiàn)并命名[1]．肌球蛋白不僅是基礎(chǔ)蛋白收縮系統(tǒng)主要成分，也是一種復(fù)雜多聚體蛋白，在真核生物肌肉收縮過程中起到很關(guān)鍵作用[2-3]．在不同的動物種類之間，乃至魚類不同品種間，肌球蛋白結(jié)構(gòu)和表達存在著種屬間差異性．大部分研究工作主要針對脊椎動物骨骼肌肉(主要是兔和雞)、心臟肌肉、數(shù)種平滑肌而進行，同時也包括部分非肌肉系統(tǒng)肌球蛋白的研究．在魚類中研究較多的是平滑肌組成的心肌肌球蛋白和橫紋肌組成的肌肉肌球蛋白[4]．肌球蛋白不同類型的重鏈基因全序列克隆測序在多種脊椎動物中已經(jīng)完成，其中包括大鼠(Rattasnorvergicus)[5]、雞[6]、人[7]以及魚類中的斑馬魚[8]、大頭魚、虹鱒[9]、鯉魚[10]，大黃魚[11]和鱖魚[12]等．因此，對魚類肌球蛋白分子研究已擴展到不同魚類品種肌球蛋白重鏈、輕鏈的基因克隆分析及其表達．Lied和Decken采用生物化學(xué)方法分離提取出虹鱒肌球蛋白重鏈，并采用此蛋白作為抗原制備出多克隆抗體，鑒定出其結(jié)合蛋白[11]．Crockford等[13]和Goldspink等[14]采用哺乳動物cDNA序列為引物從鯉魚基因文庫中克隆出其肌球蛋白重鏈基因，且證實此類基因表達受環(huán)境因子所控制；Kato和Konno測定出鯉魚重鏈氨基末端和羥基末端分子結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)區(qū)域[15]．有關(guān)魚類肌肉特異性基因肌球蛋白輕鏈(myosin light chains，MLC)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chains，MyHC)的cDNA序列分析所獲取的數(shù)據(jù)，為蛋白質(zhì)和基因結(jié)構(gòu)進化分析提供基礎(chǔ)．這些克隆和分離的基因已經(jīng)用于研制核酸雜交探針，來研究肌球蛋白基因家族轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異性組織表達、進化，以及染色體定位或突變等．

本研究旨在通過將鱖魚肌球蛋白重鏈基因片段亞克隆到pET-32a質(zhì)粒，構(gòu)建出重組表達載體，大量誘導(dǎo)表達此蛋白，制備鱖魚肌球蛋白重鏈多克隆抗體，為日后分析鱖魚肌球蛋白重鏈基因表達對其肉質(zhì)性狀的影響，進而提高魚類肉質(zhì)品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持．

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要試劑

體重1 kg 左右的鮮活鱖魚購買于長沙水產(chǎn)市場，剪腮放血后取背部白色肌肉，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫竽c桿菌菌種BL21(DE3)和DH5α均購于北京天根公司．原核表達載體pET-32a為本實驗室保存．限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ購于TAKARA公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；100 bp Marker、MarkerⅢ、PCR擴增所需的試劑以及一抗Anti-His Antiboby 和二抗羊抗鼠購于北京天根公司；T4DNA連接酶、低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染及非預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購于Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于Promega公司；His融合蛋白純化預(yù)裝柱購于上海悅克生物科技有限公司．羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)二抗、DBA顯色試劑盒購于武漢博士德生物公司．其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)作者已克隆得到的鱖魚MyHC全長序列(GenBank：HQ829291)及原核表達載體pET-32a的載體圖譜，利用Primer Premer5.0軟件設(shè)計一對引物，其序列分別為：

上游引物P+ 5′CAGAATTCATGGAAGAGTCCATTGAGGCTG3′(雙下劃線部分為引入的EcoRⅠ 酶切位點，粗體字為引入的起始密碼子)；

下游引物P-5′GCGAAGCTTCTAGTTCCTCTTGATTTGCTCC3′(雙下劃線部分為引入的HindⅢ 酶切位點，粗體字為引入的終止密碼子)．

1.2.2 目的基因PCR擴增 采用Trizol一步抽提法提取鱖魚肌肉組織的總RNA后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)合成第一鏈cDNA，并以其為模板進行PCR擴增．PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min； 94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)10 min．PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA膠回收試劑盒進行純化．

1.2.3 原核表達載體構(gòu)建 pET-32a質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ 雙酶切處理回收后與同種酶雙酶切后的PCR純化產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下16 ℃過夜，將目的基因定向連接到pET-32a載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種于含50 mg/L氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基平板上37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，挑選陽性克隆送上海生工生物有限公司測序．

1.2.4 重組質(zhì)粒的原核表達及重組蛋白的純化 把構(gòu)建好的表達載體pET-32a-MyHC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，取單個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過夜，取上述培養(yǎng)物以體積比1∶100比例接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h左右，至OD600值達0.5時，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對照，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol/L的IPTG，37 ℃分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5 h，收集菌液進行150 g/L SDS-PAGE電泳，觀察不同IPTG濃度和誘導(dǎo)時間對目的蛋白表達量的影響．

1.2.5 抗血清的制備 用 Ni-NTA 純化表達的鱖魚MyHC融合蛋白，然后將純化的MyHC融合蛋白皮下多點注射新西蘭兔，共免疫3次．注射的抗原均為MyHC蛋白與弗氏完全佐劑按體積比1∶1混合液．首次免疫后，每隔兩周加強免疫一次．末次加強免疫后兩周采集少量血液，ELISA檢測血清抗體效價．之后，頸動脈放血，離心分離血清，即得到鱖魚MyHC蛋白的多克隆抗體，分裝后-80 ℃保存．

1.2.6 Western blot分析抗體特異性 使用哺乳動物細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取鱖魚肌肉組織總蛋白，-20 ℃保存?zhèn)溆茫謩e取空白質(zhì)粒pET-32a細(xì)菌裂解液、鱖魚肌肉總蛋白、純化的MyHC蛋白，經(jīng)100 g/L SDS-PAGE電泳后濕法轉(zhuǎn)到NC膜上，使用50 g/L脫脂奶粉/TBST 4 ℃封閉過夜．加入一抗(兔抗MyHC血清，濃度比1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育，TBST清洗3次后加入二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，濃度比1∶2 000稀釋)，TBST清洗，HRP-DAB顯色，至出現(xiàn)明顯條帶后終止反應(yīng)．

1.2.7 免疫組化分析抗體的特異性 石蠟切片脫蠟、水化；3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2室溫孵育15 min；蒸餾水沖洗，微波爐內(nèi)抗原修復(fù)15 min；自然冷卻后，蒸餾水沖洗；PBS沖洗3次，每次5 min；50 g/L BSA室溫封閉30 min；傾去封閉液，滴加濃度比1∶2 000稀釋的兔抗MyHC多克隆抗體(一抗)，室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗生物素標(biāo)記兔IgG(濃度比1∶1 000)，室溫孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；BCIP/NBT顯色；自來水沖洗，核固紅輕度復(fù)染，水洗，干燥后水溶性封片劑封片，鏡檢．用PBS代替一抗作為陰性對照．

2 實驗結(jié)果

2.1 重組表達載體pET-32a-MyHC的構(gòu)建

將重組表達質(zhì)粒pET-32a-MyHC經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定結(jié)果如圖1．其中，大于4 500 bp條帶為酶切載體大小，500 bp左右的條帶為目的基因片段大?。瑫r以單菌落為模板，經(jīng)菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖2，可見在500～600 bp間有一條明顯的特異條帶．

M：Marker Ⅲ；1：重組質(zhì)粒雙酶切 M：100 bp Marker；1：菌落PCR圖1 pET-32a-MyHC酶切鑒定瓊脂糖電泳結(jié)果 圖2 目的基因片段菌落PCR鑒定結(jié)果

挑選陽性重組克隆菌送至上海英竣生物技術(shù)有限公司測序，獲得了一條1 078 bp的基因序列，通過DNAstar軟件分析，該序列37-621位核苷酸序列(包括酶切位點)與預(yù)期插入pET-32a載體的肌球蛋白重鏈基因片段一致，該目的基因片段長567 bp．重組表達菌體測序結(jié)果與原序列完全一致，且有很好的完整性，說明MyHC目的片段按正確方向插入了pET-32a表達載體中，成功構(gòu)建了表達載體pET-32a-MyHC．

2.2 鱖魚MyHC原核表達及條件優(yōu)化

將重組表達載體pET-32a-MyHC(實驗組)和空載體pET-32a(對照組)轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，分別利用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3和圖4．其中，對照組顯示一條相對分子質(zhì)量約為17 000的特異性條帶，即為pET載體的His標(biāo)簽蛋白；而實驗組在相對分子質(zhì)量約40 000處出現(xiàn)一條較明亮的條帶，即為His-MyHC融合蛋白．His標(biāo)簽蛋白的相對分子質(zhì)量約為17 000，而插入的小清蛋白目的片段預(yù)測其蛋白相對分子質(zhì)量大約為25 000，因此，MyHC融合蛋白的相對分子質(zhì)量理論上接近40 000，這與SDS-PAGE電泳結(jié)果一致，表明重組表達質(zhì)粒pET-32a-MyHC經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌BL21中成功表達出His-MyHC融合蛋白．

M：蛋白Marker ； 1～5：不同IPTG濃度誘導(dǎo)的含pET-32a-MyHC的BL21菌體，其IPTG濃度依次為0，0.2，0.6，0.8，1.2 mmol/L；6：0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的含pET-32a的BL21菌體圖3 鱖魚MyHC基因不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達結(jié)果

M：蛋白Marker ；1，2：0.8 mmol/L IPTG下誘導(dǎo)的含pET-32a的BL21菌體；3-8：誘導(dǎo)0，1，2，3，4，5 h誘導(dǎo)的含pET-32a-MyHC的BL21菌體圖4 鱖魚MyHC基因不同時間誘導(dǎo)表達結(jié)果

2.3 MyHC重組融合蛋白表達形式

0.8 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后，菌體進行超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示上清液中有目的條帶，如圖5，證明MyHC重組蛋白主要以可溶的形式存在．

2.4 Western-blot鑒定重組融合蛋白

重組蛋白pET-32a-MyHC在SDS-PAGE電泳后，通過電轉(zhuǎn)移將表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，利用抗His為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG-HRP為二抗，在HRP-DAB底色顯色反應(yīng)下，對pET-32a-MyHC轉(zhuǎn)化到BL21菌中并表達的重組融合蛋白進行Western檢測分析(圖6右)，結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的目的蛋白pET-32a-MHC可以和抗體發(fā)生強烈的免疫反應(yīng)．因此可以確定重組載體成功表達了重組融合蛋白(相對分子質(zhì)量約40 000的蛋白為目的蛋白)．

M：蛋白Marker;1：未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；2：含重組質(zhì)粒菌體誘導(dǎo)后破碎沉淀；3：含重組質(zhì)粒菌體誘導(dǎo)后破碎上清液圖5 MyHC融合蛋白表達的SDS-PAGE分析

2.5 間接ELISA對抗體效價的測定

以純化后的表達產(chǎn)物融合蛋白MyHC作為抗原，100 μg /孔包被，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體作為二抗，用免疫后的兔血清抗體做梯度稀釋，以免疫前兔血清為陰性對照，ELISA間接法測抗體，結(jié)果顯示陰性對照一直無明顯的變化，而當(dāng)多克隆抗體稀釋倍數(shù)為4.0×106時，純化好的融合蛋白與陰性對照OD值比仍大于2倍．因此，融合蛋白MyHC對兔抗多克隆抗體具有良好的免疫原性，抗體滴度為1∶(4×106)(圖7)．

2.6 鱖魚MyHC蛋白免疫印跡

分別取空白質(zhì)粒pET-32a細(xì)菌裂解液，抽提鱖魚肌肉總蛋白(蛋白提取液：1%的NP-40(體積分?jǐn)?shù)，下同)；1 g/L SDS；9.1 mmol/L Na2HPO4；2.94 mmol/L NaH2PO4；0.15 mol/L NaCl；10% PMSF；5 g/L Leupeptin；5 g/L NaDeoxgcholate)，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至NC膜上，50 g/L脫脂牛奶4 ℃封閉過夜．加入一抗(兔抗MYH血清，1∶5 000稀釋)，TBST(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)為0.05% Tween 20)清洗3次，每次5 min；然后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋，室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min；最后加入DAB顯色，待出現(xiàn)明顯條帶后用水沖洗終止反應(yīng)．

預(yù)測鱖魚肌球蛋白重鏈蛋白相對分子質(zhì)量約為 240 000[16]．用自制的MYH抗兔血清對鱖魚總蛋白的western blotting 結(jié)果(圖8)顯示，在相對分子質(zhì)量為240 000左右出現(xiàn)清晰的條帶，見圖中第3泳道；而陰性對照空白pET-32a見圖中第4泳道，在相應(yīng)位置未識別出該蛋白條帶．Western免疫印跡實驗表明，MyHC抗血清可以與肌細(xì)胞中相對分子質(zhì)量為240 000左右的蛋白質(zhì)發(fā)生特異性交叉反應(yīng)，與文獻報道的MyHC的相對分子質(zhì)量一致，顯示MyHC多克隆抗體具有高的特異性．

圖7 間接ELISA測抗血清效價

M1：非預(yù)染蛋白Marker；1：陰性對照(pET-32a質(zhì)粒細(xì)菌裂解液)；2：鱖魚肌肉總蛋白.M2：預(yù)染蛋白Marker ；3：鱖魚肌肉總蛋白；4：陰性對照(pET-32a質(zhì)粒細(xì)菌裂解液)圖8 (A)鱖魚肌肉總蛋白SDS-PAGE檢測結(jié)果 (B)鱖魚MyHC蛋白免疫印跡結(jié)果

2.7 免疫組化結(jié)果

由圖9(放大倍數(shù)200×)可以看出，兔抗MyHC多克隆抗體免疫鱖魚肌肉，在背部的肌肉細(xì)胞產(chǎn)生陽性細(xì)胞(圖9B)，呈黃棕色(灰度處理后為深灰色)，而在陰性對照組中未出現(xiàn)該陽性信號(圖9A)，與預(yù)想結(jié)果一致，說明該抗體是特異性的．

A 陰性對照 B 陽性圖9 鱖肌肉MyHC免疫組化結(jié)果

3 討論

為了獲得穩(wěn)定的目的基因片段和可溶狀態(tài)的重組蛋白，克隆片段起始位置應(yīng)位于保守性較高且親水性高的區(qū)域．作者在設(shè)計引物前利用DNAstar軟件對鱖魚肌球蛋白重鏈基因進行親/疏水性預(yù)測[16]，結(jié)果顯示鱖魚肌球蛋白重鏈基因親水性氨基酸多集中于850～1 983位．分析鱖魚MyHC的保守結(jié)構(gòu)[17]，作者選擇在Myosin_tail_1親水性氨基酸集中的區(qū)域(1 404～1 592位氨基酸)對應(yīng)的核苷酸序列進行克隆和表達．基因的高效表達是在載體、基因和受體細(xì)胞的協(xié)同作用下完成的，主要受啟動子、SD序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、載體系統(tǒng)等因素的影響[18-21]．宿主的選擇及培養(yǎng)條件的控制等因素對外源基因在原核細(xì)胞中的表達效率也有很大影響．本實驗所選用的表達載體大腸桿菌BL21具有T7啟動子，可通過化學(xué)誘導(dǎo)高效地表達外源蛋白，目的蛋白前端的促溶蛋白(相對分子質(zhì)量約為17 000)可以增加蛋白的表達及可溶性．同時，BL21含有6個組氨酸標(biāo)簽，可以提高外源表達蛋白的表達效率而不影響目的蛋白的高級結(jié)構(gòu)，從免疫組化和免疫印跡結(jié)果來看, 作者表達出的帶有His標(biāo)簽的蛋白也沒有影響到抗原抗體特異結(jié)合的性質(zhì)[22]．同時多聚組氨酸標(biāo)簽對外源重組蛋白的純化也具有一定的作用．

進行融合蛋白誘導(dǎo)時， 蛋白極易以包涵體的形式表達， 而包涵體形成后的缺點是需變性、 復(fù)性等復(fù)雜處理過程后才能得到可溶性融合蛋白質(zhì)．為了避免變性復(fù)性等復(fù)雜過程，通過改變誘導(dǎo)的時間和 IPTG的濃度，摸索到最適宜的條件為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h．

肌球蛋白重鏈( MyHC)具有ATPase活性、肌動蛋白結(jié)合位點以及a螺旋卷曲螺旋尾部等重要特性，是決定肌纖維收縮性質(zhì)的主要分子之一．本研究以前期研究中已經(jīng)克隆的鱖魚MyHC序列[23-24]為目的基因，利用大腸桿菌BL21作為表達載體，對目的基因進行原核表達載體的構(gòu)建和多克隆抗體的制備．研究成果為進一步研究肌球蛋白重鏈對肉質(zhì)的影響，提高優(yōu)良肉質(zhì)性狀提供理論支持．

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