果蠅血液發(fā)育標(biāo)記基因mrj的多克隆抗體制備及檢測(cè)

雷旻音,楊 哲,黃 婷,劉 丹,李永青,吳秀山

(湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)及魚類發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,心臟發(fā)育研究中心,中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

mrj位于果蠅2號(hào)染色體右臂,全長(zhǎng)18 474 bp,在其2-61個(gè)氨基酸處含有一個(gè)Dnaj的結(jié)構(gòu)域.Dnaj包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:N末端是與DnaK相互作用結(jié)構(gòu)域,C末端是底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域.識(shí)別底物多肽的共有基序中間是4～5個(gè)疏水氨基酸殘基的核心,兩側(cè)是酸性氨基酸殘基[1].在蛋白質(zhì)氨基酸順序中每有36個(gè)氨基酸殘基就有一個(gè)這樣的基序,這種基序常常存在于β片層中.由該結(jié)構(gòu)域表明該基因編碼蛋白具有熱休克及可穩(wěn)定蛋白前體的非折疊構(gòu)象的分子功能.有文獻(xiàn)表明mrj和NFAT3c和srp在同一信號(hào)通路,NFAT3c突變可導(dǎo)致暫時(shí)性缺氧[2],而srp是果蠅血液的標(biāo)志基因,因此作者推測(cè)mrj可能在果蠅血液的發(fā)育過程中起作用,因此mrj多克隆抗體的制備可用于果蠅血液發(fā)育信號(hào)通路的分析.另外有文獻(xiàn)表明在果蠅體內(nèi)mrj基因發(fā)生突變后,會(huì)影響果蠅細(xì)胞間的粘連[3].因此mrj基因的原核表達(dá)分析及其多克隆抗體的制備具有一定的研究意義和應(yīng)用價(jià)值[4-5].

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

大腸桿菌Rosetta菌種,PET-28a載體菌種以及E.coliDH5α菌種為本實(shí)驗(yàn)室保種；pMD18-T載體和連接酶購(gòu)自大連寶生物公司;10×Loading buffer, Taq DNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SacⅠ購(gòu)自深圳晶美公司；RNase購(gòu)自Sangon公司；UNIQ-10柱式DNA 膠回收純化試劑盒、蛋白胨、酵母提取物、甲叉雙丙烯酰胺、IPTG(異丙基-в-D-硫代半乳糖苷)丙烯酰胺、氯化鈉、過硫酸銨、等購(gòu)自上海生工公司；質(zhì)粒提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自O(shè)MEGA；柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN；Glutathione SepharoseTM4B,購(gòu)自Amersham Biotech公司;弗氏完全佐劑、不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司.

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

利用 Peptide antigen finder軟件篩選出mrjDNA序列的親水區(qū)域,然后用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì):mrj正義引物(sense):5′CGCGTCGACCATGGTTGACTAC3′(劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn))；反義引物(Anti-sense)5′CGCCTCGAGCTATTGAAGGGAG3′(劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn)),引物由上海生工公司合成.

1.3 基因擴(kuò)增及克隆

收集野生型果蠅約30只,置于液氮中30 min,接著用Trizol法提取總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄得到果蠅cDNA,并以之為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件為:95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 30 s,28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min).將含有780 bp目的片段的PCR產(chǎn)物純化回收后,連接至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,通過NcoⅠ和SacⅠ雙酶切檢測(cè)后,篩選出陽(yáng)性單克隆,選擇一個(gè)陽(yáng)性克隆送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序分析,將測(cè)序正確的pMD18-T-mrj重組質(zhì)粒上的目的DNA片段用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SacⅠ切下,純化回收后連入pET-28a載體,轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中,提取質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和SacⅠ雙酶切驗(yàn)證后得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-mrj.

1.4 mrj融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a-mrj用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株Rosetta,LB培養(yǎng)基(含100 mg/L 氯霉素,卡那霉素)37 ℃培養(yǎng),轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.6,按0.1 mmol/L 加入IPTG, 25 ℃誘導(dǎo),2、4、5、6 h各取1 mL菌液,確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間[6].

1.5 mrj融合蛋白親和純化

通過各時(shí)段取樣比較,選擇在IPTG濃度為0.1 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)5 h的條件下進(jìn)行大量誘導(dǎo).離心收集菌體,PBS 重懸細(xì)胞后超聲裂解細(xì)胞至菌液清亮,接著12 000 r/min離心 10 min,收集上清. 4 ℃下與經(jīng)Binding Buffer漂洗活化后的Ni-IDA凝膠柱結(jié)合,用Washing Buffer洗去雜蛋白,再用Elution Buffer洗脫目的蛋白,獲得純化的His-mrj融合蛋白,-80 ℃保存?zhèn)溆肹7].

1.6 mrj多克隆抗體的制備

將純化得到的His-mrj蛋白質(zhì)凍干,取1 mg 抗原蛋白溶于0.5 mL 生理鹽水中,按體積比1∶1 與弗氏完全佐劑(Sigma 公司)在注射器中推成乳劑,對(duì)2 月齡雄性新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下免疫注射,分散10～20 個(gè)點(diǎn)；在第14天、第21天、第28天再將溶于0.5 mL 生理鹽水中的0.5 mg 抗原蛋白與弗氏不完全佐劑(Sigma 公司)按體積比1∶1 在注射器中推成乳劑,進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射.第35天頸主動(dòng)脈取血.兔血放在4 ℃冰箱靜置過夜后,以3 000 r/min離心10 min,取血清分裝保存于-80 ℃.

1.7 mrj多克隆抗體的檢測(cè)

收獲免疫兔血清,用果蠅心臟組織蛋白進(jìn)行mrj抗體的效價(jià)測(cè)定,設(shè)置抗體稀釋濃度分別為1∶500,1∶1 000,1∶2 000,1∶3 000.同等條件下,用免疫前兔血清進(jìn)行Western blot分析作為對(duì)照.

2 結(jié)果

2.1 mrj基因克隆至表達(dá)載體

A: NcoⅠ/Sac Ⅰ雙酶切結(jié)果;B: pET-28a-mrj質(zhì)粒示意圖圖1 雙酶切鑒定及pET-28a-mrj質(zhì)粒示意圖

將mrj基因部分編碼序列連入pMD-18-T載體中,再用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SacⅠ雙酶切pMD18-T-mrj,將得到的mrj基因目的片段連入pET-28a,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,經(jīng)NcoⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定(如圖1:A)及測(cè)序分析,結(jié)果顯示已成功構(gòu)建了pET-28a-mrj(如圖1:B).

2.1 mrj融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-mrj轉(zhuǎn)入Rosetta菌株,以不同濃度IPTG(0、0.1、0.2、0.4 mmol/L)25 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo),取IPTG濃度為0.1 mmol/L誘導(dǎo)2,4,5,6 h,IPTG濃度為0.2 mmol/L誘導(dǎo)2,4,6 h的菌液各1 mL進(jìn)行檢測(cè),可見一條相對(duì)分子質(zhì)量約為33 000大小的特異條帶,與預(yù)期的mrj融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致(如圖2)[8-9].

2.2 mrj融合蛋白的表達(dá)及純化

通過對(duì)比,最終選擇在誘導(dǎo)溫度25 ℃,IPTG濃度為0.1 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)5 h的條件下大量誘導(dǎo)得到可溶蛋白.并將誘導(dǎo)所得融合蛋白經(jīng)Ni-IDA凝膠柱親和純化,通過免疫印記及考馬斯亮藍(lán)染色后顯示目的條帶純度較高,可進(jìn)行蛋白免疫(如圖3).

M:Marker0671；1:pET-28a-mrj未誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；2:0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET-28a-mrj 2 h時(shí)蛋白表達(dá)；3:0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET-28a-mrj 4 h時(shí)蛋白表達(dá)；4:0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET-28a-mrj 5 h時(shí)蛋白表達(dá)；5:0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET-28a-mrj 6 h時(shí)蛋白表達(dá)；6:0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET-28a-mrj 2 h時(shí)蛋白表達(dá)；7:0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET-28a-mrj 4 h時(shí)蛋白表達(dá)；8:0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)pET-28a-mrj 6 h時(shí)蛋白表達(dá).圖2 pET-28a-mrj誘導(dǎo)表達(dá)圖

圖3 融合蛋白His-mrj的純化圖

2.3 mrj多克隆抗體Western Blot鑒定

用pET-28a-mrj轉(zhuǎn)化Rosetta菌株誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白對(duì)所制備的mrj多克隆抗體的特異性進(jìn)行Western blot檢測(cè),將制備的多克隆抗體按濃度梯度稀釋(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000)作為一抗進(jìn)行檢測(cè),并用空白血清作為陰性對(duì)照,可見His-mrj蛋白所處位置有一條特異性的雜交帶出現(xiàn)(如圖4),檢測(cè)結(jié)果表明該抗體的特異性和敏感性均可達(dá)到今后實(shí)驗(yàn)需要[10].

2.4 mrj多克隆抗體有效性的鑒定

用RNAi干擾品系,利用western blot鑒定所制備mrj多克隆抗體的有效性.將制備的mrj多克隆抗體按照1∶2 000的濃度比稀釋作為一抗,用野生型果蠅胚胎作陰性對(duì)照[11](如圖5).

圖4 mrj多克隆抗體Western-blotting鑒定

圖5 mrj多克隆抗體有效性的鑒定

3 討論

真核細(xì)胞的密碼子和原核系統(tǒng)的不同,因此,在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候,真核基因中的一些密碼子對(duì)于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子,從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低.本實(shí)驗(yàn)所用宿主菌株為Rosetta菌株，因?yàn)橄啾容^BL21菌株,Rosetta 是攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌,能補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG)對(duì)應(yīng)的 tRNA,可提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平.另外,Rosetta還能夠促進(jìn)二硫鍵的形成,幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白.

本實(shí)驗(yàn)所用免疫動(dòng)物為2月齡雄性新西蘭大白兔,因?yàn)榇菩詣?dòng)物特別是妊娠動(dòng)物用于制備免疫有時(shí)不產(chǎn)生抗體.由于對(duì)免疫應(yīng)答存在個(gè)別差異,免疫時(shí)應(yīng)同時(shí)選用數(shù)只動(dòng)物進(jìn)行免疫. 抗原的免疫劑量依照給予動(dòng)物的種類、免疫周期以及所要求的抗體特性等不同而不同.劑量過低,不能引起足夠強(qiáng)的免疫刺激；免疫劑量過多,有可能引起免疫耐受.在一定的范圍內(nèi),抗體的效價(jià)隨注射劑量的增加而增高.蛋白質(zhì)抗原的免疫劑量比多糖類抗原高. 免疫劑量與注射途徑有關(guān).通常,靜脈注射劑量大于皮下注射,而皮下注射又比掌內(nèi)和跖內(nèi)皮下注射劑量大,也可采用淋巴結(jié)內(nèi)注射法.加佐劑比不加佐劑的注射劑量小.如要制備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法.如需要獲得高效價(jià)的抗血清,宜采用大劑量長(zhǎng)程免疫法.免疫周期長(zhǎng)者,可少量多次；免疫周期短者,應(yīng)大量少次. 兩次注射的間隔時(shí)間應(yīng)長(zhǎng)短適宜,太短起不到再次反應(yīng)的效果,太長(zhǎng)則失去了前一次激發(fā)的敏感作用.一般間隔時(shí)間應(yīng)為5～7 d,加佐劑者應(yīng)為2周左右.

雖然用純化蛋白檢測(cè)所制備多克隆抗體的效價(jià)時(shí)在一定程度上驗(yàn)證了干抗體的有效性,但western-blot實(shí)驗(yàn)時(shí)所用蛋白一般為果蠅胚胎提取的全蛋白,此時(shí),若所制備的抗體特異性不強(qiáng),實(shí)驗(yàn)中非目的條帶過多會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性.

mrj是果蠅發(fā)育中一個(gè)關(guān)鍵的標(biāo)志基因[12],我們所熟知的是它可與尿激酶受體共同作用增強(qiáng)細(xì)胞間的粘連[13].但有文獻(xiàn)表明它很可能與果蠅的血液發(fā)育相關(guān),因此mrj多克隆抗體在今后的實(shí)驗(yàn)中還可用做體內(nèi)CO-ip實(shí)驗(yàn),尋找在體內(nèi)與其有相互作用的蛋白,或干擾其所在信號(hào)通路的其他蛋白,將該多克隆抗體用作胚胎抗體染色,或western-blot等實(shí)驗(yàn).

參考文獻(xiàn):

[1] MITRA A, MENEZES M E, SHEVDE L A,etal. DNAJB6 induces degradation of beta-catenin and causes partial reversal of mesenchymal phenotype[J].J Biol Chem, 2010,285(32):24686-24694.

[2] WATSON E D, HUGHES M, SIMMONS D G,etal. Cell-cell adhesion defects inMrjmutant trophoblast cells are associated with failure to pattern the chorion during early placental development[J]. Dev Dyn, 2011,240(11):2505-2519.

[3] NANDURI J, YUAN G, KUMAR G K,etal. Transcriptional responses to intermittent hypoxia[J].Respir Physiol Neurobiol, 2008,164(1-2):277-281.

[4] 吳秀山,王躍群,袁婺洲,等.心臟發(fā)育概論[M].北京:科學(xué)出版社, 2006:141-143.

[5] 吳秀山,袁婺洲,王躍群,等.心臟發(fā)育研究[M].長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 2004:214-302.

[6] 滿 賢,吳秀山,李永青,等.斑馬魚Lefty1特異性多克隆抗體的制備[J].激光生物學(xué)報(bào), 2010,19(5)：658-689.

[7] 劉 紅,任笑蒙,李 君,等.果蠅組織總RNA的電泳譜型鑒定[J].醫(yī)學(xué)研究通訊, 2004,33(4):48-49.

[8] 唐威華,張景六,王宗陽(yáng),等.SDS-PAGE法測(cè)定His-tag融合蛋白分子量產(chǎn)生偏差的原因[J].植物生理學(xué)報(bào), 2010,33(1):64-68.

[9] 張守濤,郭藹光.Fibrolase表達(dá)菌自誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,36(9):3715-3716．

[10] 王雁云,羅開梅,李永青,等.一種快速的胚胎組織總RNA的提取方法[J].生命科學(xué)研究, 2001,5(1):88-90.

[11] 龔 琳,王躍群,袁婺洲,等.果蠅nulp1特異性多克隆抗體制備及檢測(cè)[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2011,34(4):69-73.

[12] 萬(wàn)永奇,謝 維.科學(xué)與人類疾病研究的重要模型—果蠅[J].生命科學(xué), 2006,18(5):425-429.

[13] BOCK C E, LIN Z, MEKKAWY A H,etal. Interaction between urokinase receptor and heat shock protein MRJ enhances cell adhesion[J]. Int J Oncol, 2010,36(5):1155-1163.