前裂長管繭蜂寄生行為對桔小實蠅幼蟲生理指標的影響

范一霖，羅 麗，曾 玲*，龍秀珍，李敦松

(1．華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣州510630;2．廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，廣州510640)

桔小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)可為害楊桃、香蕉、柑桔、番石榴等多種水果、蔬菜及野生植物 (Christenson and Foote，1960;Allwood and Drew，1997)，食性雜、寄主廣泛，對我國的果蔬生產(chǎn)構成巨大威脅 (梁廣勤等，2008)。桔小實蠅的寄生性天敵種類較多，近年來，許多學者致力于桔小實蠅寄生性天敵的研究與利用工作，有關研究報道了桔小實蠅的一種寄生蜂－切割潛蠅繭蜂Psyttlia incise(Silvestri)，并研究了該蜂對桔小實蠅的功能反應 (季清娥，2004;梁光紅等，2006);也有學者研究了昆蟲病原線蟲對桔小實蠅的控制作用 (林進添等，2005)。

前裂長管繭蜂Diachasminorpha longicaudata(Ashmead)屬膜翅目Hymenoptera，姬蜂總科Ichneumonidea，繭蜂科Bracoindae，對實蠅類害蟲有很好的控制作用，是利用較為成功的一種。國外對于前裂長管繭蜂的研究工作主要集中于室外釋放、田間種群建立并聯(lián)合其它防治手段進行害蟲綜合控制 (Wong，1991;Renato et al.，1997)。該蜂由卵、幼蟲、蛹及成蟲四個階段構成，以桔小實蠅為寄主時，約經(jīng)過20 d完成世代發(fā)育 (邵屯，2008)。

寄生蜂的寄生作用可以引起寄主各方面生理狀況的改變，主要體現(xiàn)在營養(yǎng)代謝、生長發(fā)育和免疫等多個方面，也會影響到寄主的生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。但尚未有對前裂長管繭蜂寄生寄主桔小實蠅后，引起的寄主各生理指標變化的報道。本文以桔小實蠅－前裂長管繭蜂為研究對象，明確兩個問題:一是在桔小實蠅生長發(fā)育過程中，不同血細胞類型濃度的變化和血淋巴中蛋白質種類的變化，二是被前裂長管繭蜂寄生后，桔小實蠅幼蟲血細胞類型、濃度的變化，血淋巴中蛋白質種類和濃度的變化，以及寄生行為對幼蟲發(fā)育歷期、質量的影響，為利用前裂長管繭蜂控制桔小實蠅提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

前裂長管繭蜂于2004年8月從泰國農(nóng)業(yè)部生物防治研究所引進，在華南農(nóng)業(yè)大學生態(tài)實驗室繁育起穩(wěn)定的種群。成蜂于養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng)，飼以清水以及30%的蜂蜜水補充營養(yǎng)。桔小實蠅采自廣州市楊桃公園的落果中，飼養(yǎng)條件為溫度25℃(±5)，相對濕度70%(±5)，使其在室內(nèi)成功化蛹并羽化后置于養(yǎng)蟲籠內(nèi)，以蒸餾水和人工飼料繁殖3代以上。實驗選取同日同批大小基本一致的桔小實蠅幼蟲。

1.2 幼蟲血淋巴中血細胞濃度和比例的測定

將處于2齡末3齡初的桔小實蠅幼蟲以近1∶1的比例置于前裂長管繭蜂養(yǎng)蟲籠中，寄生6 h后取出，在體視鏡下觀測。被寄生的幼蟲體表有明顯的棕褐色的產(chǎn)卵孔，化蛹后其蛹殼上的產(chǎn)卵孔仍然清晰可見 (圖1、圖2)，篩選出被寄生的桔小實蠅幼蟲。

挑選未寄生桔小實蠅2齡、3齡、蛹前期的幼蟲為一組進行實驗，挑選寄生和未寄生的桔小實蠅幼蟲為另外一組進行實驗。75%的酒精清洗體表，再用pH=7.4的PBS沖洗3次，濾紙擦干，取幼蟲的血淋巴。分別提取各處理幼蟲血淋巴10μL，加入10μL的抗凝緩沖劑和20μL的PBS，混合均勻。將細胞計數(shù)板置于顯微鏡下，采用5點取樣法，觀察3次，取平均值。根據(jù)公式計算:血細胞濃度=80個小方格的總數(shù)/80×4×106×稀釋倍數(shù)/mL(郭軍英，2009)。

分別取各處理幼蟲的血淋巴各10μL，加入10μL的抗凝劑和10μL的PBS，混勻，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下，采取5點取樣法觀察每種細胞的數(shù)目，計算出比例。共10個處理，取平均值。

1.3 SDS-PAGE測定幼蟲血淋巴中蛋白質種類

用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的種類。取桔小實蠅5日、6日、7日和8日的幼蟲為一組進行實驗。另挑選寄生行為發(fā)生4 h、8 h、24 h和48 h后的被寄生和未被寄生的桔小實蠅幼蟲為另一組進行實驗。分別取桔小實蠅血淋巴10μL，用Ringer's生理鹽水稀釋成40μL的蛋白質樣品，加入10μL 5×蛋白上樣緩沖液，輕輕震蕩使其充分混合。100℃下加熱5～10 min，離心1 min。取10μL Marker，加入合適的樣品孔中，其余樣品操作同上。本實驗采用的Marker分子量為118、90、50、36、27、20 kDa。濃縮膠采用80V電壓，至分離膠時采用120V電壓?？捡R斯亮藍染色后脫色直至清晰地條帶顯現(xiàn)出來，Bio凝膠成像儀進行拍照。

1.4 幼蟲血淋巴蛋白質濃度的測定

采用考馬斯亮藍法測定幼蟲血淋巴蛋白質濃度。在體視鏡下挑選出寄生過的幼蟲，將寄生過的桔小實蠅幼蟲重新置入飼料中飼養(yǎng)，4 h、8 h、20 h、24 h、32 h、48 h后分別提取血淋巴，收集于1.5 mL的離心管中。取同批未寄生的幼蟲血淋巴，作為對照，以10000 r/min的速度離心，取上清液，置于－40℃下保存。取6支具塞試管，按表1所示加入不同量的溶液，放置10 min后，于595 nm處測其吸光值，重復3次，取其平均值，繪制出標準曲線。

取若干具塞試管，在試管分別中加入5 mL考馬斯亮藍G－250，再加入1 mL稀釋1000倍的寄生和未寄生的桔小實蠅幼蟲血淋巴，以空白試劑為對照。在室溫下反應5～10 min。使用紫外可見分光光度計在595 nm的條件下測出吸光度值，重復3次，取平均值。根據(jù)標準曲線計算得出蛋白濃度。

表1 Braford檢測法標準曲線配制Table 1 The formulation of standard graph using Braford

1.5 寄生行為對桔小實蠅幼蟲發(fā)育歷期、體重的影響

選用桔小實蠅4日齡的幼蟲，以1∶1的比例放入裝有羽化2 d～3 d的前裂長管繭蜂籠中，寄生6 h后取出。分別挑選出30頭寄生及未寄生的幼蟲，單頭飼養(yǎng)。觀測其外觀、發(fā)育歷期以及體重的變化。每處理3個重復。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用Excel進行繪圖。電泳圖用Quantity軟件進行圖像分析。

2 結果與分析

2.1 不同日齡桔小實蠅幼蟲血淋巴中血細胞的濃度、比例差異和蛋白種類差異

桔小實蠅的幼蟲血淋巴中存在3種不同類型的血細胞:第1類細胞的細胞膜平滑，顯微鏡下細胞質細胞核清晰，稱之為A類細胞。第2類細胞的細胞膜表面不平滑，有伸出的偽足，稱之為B類細胞。第3類細胞的細胞膜表面平滑，但內(nèi)部物質凝為一團，稱之為C類細胞 (C類細胞在幼蟲血淋巴中的數(shù)量非常少，故在本實驗中忽略不計)。

對不同齡期桔小實蠅幼蟲血細胞的研究，結果表明，桔小實蠅幼蟲血細胞濃度約為15～40×106個/mL，隨著蟲齡的增加，血細胞的濃度呈上升趨勢，從2齡的16.53×106個/mL、3齡的30.14×106個/mL，升至蛹前期的 35.94×106個/mL。在3個發(fā)育階段中，A類 (無偽足)細胞的濃度均顯著低于B類 (有偽足)細胞。A類細胞濃度呈現(xiàn)先下降后再上升的趨勢，但各個齡期的差異不顯著，分別為3.13×106個/mL、2.87×106個/mL、4.87×106個/mL;B類細胞濃度則呈現(xiàn)一直上升趨勢，從2齡幼蟲的13.4×106個/mL顯著升高至 3齡時期的 27.27×106個/mL，再升至蛹前期的31.07×106個/mL，后者差異不顯著 (圖3)。

在2齡、3齡以及蛹前期的桔小實蠅幼蟲血淋巴中，A類 (無偽足)細胞所占的比例比B類(有偽足)細胞的低。3個時期的A類細胞所占的比例分別為22.59%、11.75%、14.41%，即先顯著下降后略微上升;B類細胞所占的比例在3個時期分別為77.41%、88.25%、85.59%，呈現(xiàn)先顯著上升后略微下降的趨勢 (圖4)。

經(jīng)SDS－PAGE，發(fā)現(xiàn)桔小實蠅幼蟲血淋巴的蛋白條帶為12條，在16 kDa～156 kDa的范圍內(nèi)，但是主要的蛋白條帶集中在35 kDa～56 kDa的范圍內(nèi)。7日齡和8日齡幼蟲血淋巴的拖尾現(xiàn)象相對比較嚴重，且分子量為43 kDa的蛋白條帶較其他幾日齡明顯，沒有明顯的特異蛋白出現(xiàn) (圖5)。

圖5 不同日齡桔小實蠅幼蟲血淋巴蛋白電泳圖Fig.5 SDS－PAGE analysis of the protein in the hemolymph among different instars

2.2 寄生行為對幼蟲血淋巴中血細胞濃度、比例的影響

實驗結果表明，被前裂長管繭蜂寄生后，桔小實蠅血淋巴中A類和B類血細胞濃度均有所下降，但均無顯著差異。A類細胞濃度由3.13×106個/mL下降至2.93×106個/mL，B類細胞由28.47×106個/mL下降至18.27×106個/mL(圖6)。寄生行為發(fā)生后，桔小實蠅血淋巴中的A類血細胞在所有血細胞中所占比例上升，由19.68%上升至28.37%。相應的B類血細胞的所占的比例則下降，由80.32%下降至71.63%，均無顯著差異 (圖7)。

對細胞形態(tài)和大小的觀測表明，寄生和未寄生的桔小實蠅幼蟲血淋巴中不同類型血細胞基本相同，沒有顯著的變化。

2.3 寄生行為對桔小實蠅幼蟲血淋巴蛋白種類的影響

SDS－PAGE分析結果表明桔小實蠅幼蟲的血淋巴蛋白條帶有12條，分子量范圍為16 kDa～156 kDa，有6條帶集中在33 kDa～56 kDa的范圍內(nèi)。寄生和未寄生的蛋白條帶差異并不明顯，在第3條泳帶上出現(xiàn)一條分子量為44.7 kDa的蛋白。這條蛋白在寄生后8 h和未寄生的幼蟲血淋巴中均有發(fā)現(xiàn)，但是在24 h開始逐步減淡，48 h已經(jīng)完全消失 (圖8)。

圖8 被前裂長管繭蜂寄生的和正常桔小實蠅幼蟲血淋巴SDS－PAGE圖譜的變化Fig.8 SDS－PAGE analysis of the protein in the hemolymph between normal and parasitized B.dorsalis

2.4 前裂長管繭蜂的寄生行為對桔小實蠅幼蟲血淋巴蛋白濃度的影響

以1.4測出的吸光度值為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標，繪出標準曲線 (圖9)。得到線性回歸方程式 Y=0.0005X+0.0103，相關系數(shù) r2=0.9902，表明蛋白質在200μg/mL～1000μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，符合郎伯－比爾 (Lamber－Beer)定律。

圖9 蛋白標準曲線Fig.9 The stardard graph

對寄生桔小實蠅幼蟲血淋巴中蛋白質的研究結果表明，寄生行為發(fā)生4 h后的桔小實蠅血淋巴蛋白質濃度比未寄生的明顯降低，且差異顯著，此后兩者的血淋巴濃度變化趨勢相似;22 h后，血淋巴蛋白濃度開始上升，至化蛹前期，蛋白濃度再次下降 (圖10)。

圖10 被前裂長管繭蜂寄生的和正常桔小實蠅幼蟲血淋巴蛋白濃度隨時間的變化Fig.10 The protein concentration of normal and parasitized B.dorsalis

2.5 寄生行為對桔小實蠅幼蟲化蛹率、發(fā)育歷期和體重的影響

實驗結果表明，被寄生過的桔小實蠅幼蟲體表比未寄生的更有通透感和膨脹感，表面更加光滑。寄生行為發(fā)生后，桔小實蠅幼蟲的發(fā)育歷期延長，從8 d延長至9～11 d(圖11)。

圖11 被前裂長管繭蜂寄生的和未寄生桔小實蠅幼蟲隨發(fā)育時間的累積化蛹率Fig.11 The difference of pupation rate between the normal and parasitized B.dorsalis

寄生行為發(fā)生后，4、5、6日齡的桔小實蠅幼蟲體重差異不明顯，均呈逐步上升趨勢;自第7 d起，未寄生的桔小實蠅幼蟲體重開始下降，而被寄生的桔小實蠅幼蟲體重則繼續(xù)呈現(xiàn)增長趨勢直至化蛹 (圖12)。

圖12 被前裂長管繭蜂寄生和未寄生桔小實蠅幼蟲隨發(fā)育天數(shù)的質量變化Fig.12 The difference of weight changes between the normal and parasitized B.dorsalis

3 結論與討論

血細胞與昆蟲的免疫反應有十分緊密的關系，其數(shù)量的多少在一定程度上反映了昆蟲的免疫能力。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，2齡時期的桔小實蠅幼蟲血細胞濃度最低。而據(jù)已有的研究表明，前裂長管繭蜂偏好寄生2齡末3齡初的幼蟲 (邵屯等，2008)，據(jù)此推測前裂長管繭蜂可挑選寄主在生理上已經(jīng)發(fā)育成熟，同時血細胞濃度相對較低的時期進行寄生，以此來盡量避免寄主血細胞的包囊。

血細胞是寄主識別和包囊外源物最重要的因子之一，寄生作用會影響到血細胞的數(shù)量和組成。菜粉蝶絨繭蜂Cotesia glomeratus寄生寄主后，引起寄主血細胞總數(shù)的升高 (Strand and Pech，1995)，而索諾齒唇姬蜂Campoletis sonorensis寄生寄主后，卻引起寄主血細胞數(shù)量的降低 (Davies，1987)。前裂長管繭蜂寄生后的桔小實蠅幼蟲的血細胞在形態(tài)和行為上雖沒有明顯變化，但在濃度和各類型細胞所占比例上均有變化，尤其是B類細胞。這些結果表明寄生行為導致具有偽足的B類細胞濃度大量下降，在一定程度上抑制了寄主血細胞的延展能力。

寄生作用能夠影響寄主蛋白質的代謝過程，調節(jié)蛋白濃度的高低，從而使其朝著有利于寄生蜂發(fā)育的方向變化，甚至會引起寄主血淋巴蛋白種類的變化。寄生行為發(fā)生初期，寄主體內(nèi)血淋巴蛋白濃度的下降，此時蜂卵剛剛發(fā)育，無法正常取食，因此直接從寄主的血淋巴中攝取營養(yǎng)物質來滿足自身的生長。在寄生22 h后，血淋巴的蛋白濃度開始高于未寄生的幼蟲蛋白濃度，寄生蜂自主調節(jié)寄主的營養(yǎng)流向，為寄生蜂后期的發(fā)育累積更多的蛋白，以提供能量。已有的研究表明，前裂長管繭蜂卵在產(chǎn)出24 h之后，漸漸膨大，近48 h基本完成胚胎的發(fā)育。產(chǎn)出32～48 h這段時間，是桔小實蠅由卵孵化為幼蟲的關鍵時期(邵屯，2008)。這與我們的研究成果是一致的，在32～48 h期間，血淋巴蛋白質的濃度快速下降，這說明寄生蜂的生長消耗了大量的營養(yǎng)物質。在寄生后8 h時血淋巴中出現(xiàn)了一條分子量為44.72 kDa的蛋白條帶，這個條帶在圖5中沒有被檢測出來，因為前者中取血淋巴的相隔周期為1 d，比此實驗長，且這條帶含量微小，在短時間內(nèi)消失，因此沒有在試驗2.1中檢測出來。雖然曾出現(xiàn)新的蛋白，但是這在寄生和未寄生的蟲體中都有存在，據(jù)此推測這條帶和桔小實蠅自身的生長發(fā)育相關，而與寄生和不寄生無關。

寄生作用可以影響寄主的生長發(fā)育、歷期變化以及營養(yǎng)代謝的變化 (Beckage and Gelman，2004)。前裂長管繭蜂寄生過的桔小實蠅幼蟲發(fā)育歷期延長，幼蟲的質量也呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。這可能是因為寄生作用促進了寄主營養(yǎng)物質的消化和寄生蜂對營養(yǎng)物質的吸收，使其在寄主體內(nèi)快速成長。

前裂長管繭蜂寄生桔小實蠅幼蟲后，引起了寄主各方面的變化，但是這些變化究竟是何種原因引起的，寄主的不同類型的血細胞在免疫反應中各發(fā)揮何種作用，都有待于進一步的研究。

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