B型煙粉虱羧酸酯酶對6種寄主植物時間響應(yīng)的初步研究

柴芳華，韓詩疇，安新城*

(1．中國科學(xué)院華南植物園，廣州510650;2．廣東省昆蟲研究所，廣州510260;3．中國科學(xué)院研究生院，北京100049)

煙粉虱Bemisia tabaci是粉虱科Aleyrodidae小粉虱屬Bemisia的一種植食性昆蟲，原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)，最早由Gennadius在希臘的煙草上發(fā)現(xiàn)(Gennadius，1889)。它是一種極端廣食性的昆蟲，寄主范圍多達(dá)900余種 (Brown et al.，1995)，被世界公認(rèn)為“超級害蟲”。它不僅能夠通過刺吸植物的汁液，導(dǎo)致植物衰弱和干枯，分泌蜜露誘發(fā)煤污病，影響植物光合作用，煙粉虱還是許多病毒的媒介，傳毒種類多達(dá)40余種 (Oliveira et al.，2001)。煙粉虱有著異乎尋常的寄主適應(yīng)能力，這是它寄主譜廣的重要原因。每年由煙粉虱對全球蔬菜、瓜果、花卉以及經(jīng)濟(jì)作物造成的損失高達(dá)數(shù)十億美元 (Byrne and Bellows，1991;Secker et al.，1998)。

植食性昆蟲與寄主植物通過長期的協(xié)同進(jìn)化，形成了相互選擇、相互作用、相互適應(yīng)的關(guān)系。寄主植物通過分泌有毒次生物質(zhì)以及調(diào)節(jié)自身的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)等措施來抵御昆蟲的取食;而昆蟲則通過調(diào)節(jié)自己的行為機(jī)制、生理機(jī)制、分子生態(tài)機(jī)制等策略來適應(yīng)不同的寄主植物 (Wan et al.，2009)，生理機(jī)制是煙粉虱最主要的寄主適應(yīng)機(jī)制之一。有研究指出，煙粉虱體內(nèi)解毒酶的活性可被寄主植物的次生物質(zhì)誘導(dǎo)增加，從而增強(qiáng)煙粉虱的寄主適應(yīng)性以及抗藥性。煙粉虱在解毒代謝過程中，多功能氧化酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、非特異性酯酶、細(xì)胞色素P450等組成了昆蟲主要的外源化合物防御體系，對于進(jìn)入昆蟲體內(nèi)的植物毒素或合成農(nóng)藥進(jìn)行有效地降解、阻隔或異化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒或低毒的化合物，從而保障昆蟲體內(nèi)代謝環(huán)境的穩(wěn)定性 (Li et al.，2007;Lindroth，1989)。研究表明，羧酸酯酶可能是煙粉虱化學(xué)防御體系中最為重要的一類解毒酶系，在寄主適應(yīng)性、農(nóng)藥抗性、激素調(diào)節(jié)、發(fā)育代謝等過程中廣泛地發(fā)揮著作用 (Gao，1992;Byrne et al.，1993;Byrne et al.，2000)。本實(shí)驗(yàn)通過研究B型煙粉虱在不同寄主植物上繁殖多代后，其體內(nèi)羧酸酯酶的時間變化規(guī)律，旨在揭示煙粉虱適應(yīng)寄主的生理機(jī)制，從而為更深層次的研究煙粉虱的寄主適應(yīng)機(jī)制、抗藥性機(jī)制、種群爆發(fā)機(jī)制以及防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

B型煙粉虱:供試煙粉虱來源于廣東省昆蟲研究所養(yǎng)蟲室內(nèi)黃瓜Cucumis sativus寄主上繁殖的實(shí)驗(yàn)種群，分別轉(zhuǎn)移至苦瓜Momondica charantia、木瓜 Carica papaya、水瓜 Luffa acutangula、薄荷Mentha haplocalyx、金銀花Lonicera Japonic上飼養(yǎng)超過40天的B型煙粉虱。

植物材料:在自然條件下生長的黃瓜、苦瓜、水瓜、木瓜、薄荷、金銀花。

1.2 試劑與儀器

α－乙酸萘酯 (α－Naphthylacetate)、牛血清蛋白 (AlbuMin bovine V)(BSA)、α－萘酚 (1－Naphthol)、毒扁豆堿 (Eserine)、考馬斯亮藍(lán)G－250(Coomassie Brilliant Blue G250)、固藍(lán) B鹽(Fsat blue Bsalt)、十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate，SDS)，均購自Sigma公司。低溫高速離心機(jī) (型號3K15)，美國sigma公司產(chǎn)品;VICTORTM3多標(biāo)記微孔板檢測儀，美國－PerkinElmer公司產(chǎn)品。

1.3 煙粉虱寄主轉(zhuǎn)移的處理

讓煙粉虱在自然生長的黃瓜樣地里繁殖多代后，分別放幾盆苦瓜、水瓜、木瓜、薄荷、金銀花，讓黃瓜寄主上的煙粉虱自由擴(kuò)散到這些非嗜好性寄主植物上，再把這些植物移出黃瓜樣地，放置在自然條件下單獨(dú)種植。煙粉虱在其上自由繁殖40 d左右后，便開始分時間段取各種植物上的煙粉虱進(jìn)行羧酸酯酶活性的測定。由于每種植物的生長周期有別，導(dǎo)致寄主植物上的落蟲量有差別，各種寄主植物上煙粉虱的采集時間存在一定差異。

1.4 羧酸酯酶活性的測定方法

羧酸酯酶活性測定的原理:用α－萘酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。底物α－乙酸萘酯在羧酸酯酶 (CarE)的作用下發(fā)生水解反應(yīng)，生成的α－萘酚與顯色劑固藍(lán)B鹽生成深藍(lán)色或深紅色物質(zhì)，在595 nm處比色測定其吸光度 (OD值)。

CarE酶源制備:取大小一致的供試煙粉虱20頭，在0.04 mo1/L pH為7.0的磷酸緩沖液中清洗，然后將其轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，加入1 mL 0.04 mo1/L pH為7.0的磷酸緩沖液 (PBS)冰浴勻漿，勻漿液在4℃下，10000 r/min離心10 min，取上清液作為酶源。

測定方法:參照Van Asperen(1962)的方法，略加改進(jìn)。取待測酶液0.1 mL，加0.5 mLα－乙酸萘酯 (含終濃度為lx10－5mol/L的毒扁豆堿液)混勻，在30℃下水浴反應(yīng)10 min后加入0.1 mL顯色劑并終止反應(yīng)，顯色30 min。測定使用96孔可拆卸式酶標(biāo)板，每孔加200μL反應(yīng)終止液，每組反應(yīng)液加3孔，借助酶標(biāo)儀于595 nm測定反應(yīng)終止液的OD值。以失活酶液做對照，通過α－萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線求出反應(yīng)生成的α－萘酚的量。每個處理重復(fù)3次。

酶源蛋白質(zhì)含量的測定:參照Bradford(1976)考馬斯亮藍(lán) G250法。取0.1 mL待測酶液，加0.5 mL考馬斯亮藍(lán)G－250染色液，混合均勻后2 min至1 h內(nèi)測OD595值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酶液蛋白質(zhì)含量。

羧酸酯酶比活力的計算公式:羧酸酯酶的比活力 (nmol·min－1·mgPro－1)=反應(yīng)生成的 α －萘酚量/(酶液蛋白質(zhì)含量*反應(yīng)時間)。

2 結(jié)果與分析

煙粉虱在苦瓜、黃瓜、木瓜、水瓜、金銀花、薄荷六種寄主植物上，從7月至10月的時間段內(nèi)，其羧酸酯酶比活力隨時間的變化趨勢，如圖1－6。

從圖中可以看出，煙粉虱在不同寄主植物上羧酸酯酶比活力隨時間的變化趨勢，用二項(xiàng)式曲線進(jìn)行擬合，其相互關(guān)系較為一致地呈開口向上的拋物線型?？喙霞闹鞯亩?xiàng)式曲線為:y=0.012x2－979.0x+2E+07，相關(guān)系數(shù)R2=0.667;黃瓜寄主的二項(xiàng)式曲線為:y=0.012x2－1046.x+2E+07，相關(guān)系數(shù)R2=0.888;木瓜寄主的二項(xiàng)式曲線為:y=0.020x2－1661.x+3E+07，相關(guān)系數(shù)R2=0.867;水瓜寄主的二項(xiàng)式曲線為:y=0.029x2－2431.x+5E+07，相關(guān)系數(shù)R2=0.994;薄荷寄主的二項(xiàng)式曲線為:y=0.028x2－2303.x+5E+07，相關(guān)系數(shù)R2=0.831;金銀花寄主的二項(xiàng)式曲線為:y=0.014 x2－1184.x+2E+07，相 關(guān) 系數(shù)R2=0.951。

圖6 金銀花寄主上煙粉虱羧酸酯酶比活力變化趨勢Fig.6 Time variation tendency of CarE specific activity of Bemisia tabaci on Lonicera Japonic

3 結(jié)論與討論

煙粉虱從嗜食寄主轉(zhuǎn)移到非嗜食寄主植物過程中，其解毒酶系通常會表現(xiàn)出活性增加的趨勢，在已有研究中，多功能氧化酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶等都受植物的影響而表現(xiàn)出不同程度的差異，基本上與煙粉虱的寄主適應(yīng)性關(guān)系相一致 (王海鴻等，2007;王紅等，2007;周福才等，2010)，但是卻未提到解毒酶活性與時間相關(guān)性及趨勢的研究報道。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，煙粉虱從嗜好寄主(黃瓜)轉(zhuǎn)移至非嗜好寄主 (苦瓜、木瓜、水瓜、薄荷、金銀花)后，其羧酸酯酶的活性雖有顯著增加的趨勢 (另文發(fā)表)，但其變化規(guī)律卻在整體上與時間相關(guān)，這與預(yù)期不一致，其規(guī)律性在嗜好寄主黃瓜上也表現(xiàn)的較為典型。周福才等在轉(zhuǎn)移至棉花、辣椒上后測得的煙粉虱羧酸酯酶在2～3代后達(dá)至平衡，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的酶活性增加趨勢卻并非是對數(shù)曲線，而是更加符合開口向上的拋物線型，分析認(rèn)為，這種趨勢可能暗示了寄主植物在生長季節(jié)過程中其次生物質(zhì)含量發(fā)生了規(guī)律性的變化，該變化的誘導(dǎo)因子可能來自于其自身的發(fā)育代謝，也可能受環(huán)境因子的影響，而與周福才等結(jié)果的不一致，則可能是由于本實(shí)驗(yàn)的植物材料生長在接近自然的室外環(huán)境中，更多地受外界環(huán)境的影響而使植物次生物質(zhì)的代謝發(fā)生了更為復(fù)雜的變化而導(dǎo)致。總之，煙粉虱在寄主植物取食過程中，其包括羧酸酯酶在內(nèi)的解毒酶系與植物次生物質(zhì)之間可能存在著緊密的互動關(guān)系，反復(fù)而細(xì)致地研究其聯(lián)動機(jī)制將有助于我們更好地理解煙粉虱的寄主植物生理適應(yīng)機(jī)制。

References)

Bradford MM，1976．A rapid and sensitive methord for the quantification of microgram quantities of protein using the principle of proteindye binding．Analytical Biochem．，72:248 －254．

Brown JK，F(xiàn)rohlich DR，Rosell RC，1995．The sweetpotato or silverleaf whiteflies:biotype of Bemisia tabaci of a species complex．Annual Review of Entomology，40:511 －534．

Byrne DN，Bellows TS，1991．Whitefly biology．Annual Review of Entomology，36:431 －457．

Byrne FJ，Devonshire AL，1993．Insensitive acetylcholinesterase and esterases polymorphism in susceptible and resistant populations of the Tabacco Whitefly，Bemisia tabaci(Genn)．Pestic Biochem．Physiol．，(45):34 －42．

Byrne FJ，Gorman KJ，Cahill M，2000．The role of B －type esterases in conferring insecticide resistance in the tabacco Whitefly，Bemisia tabaci(Genn)．Pest Manag．Sci.，56(10):867－874．

Gao XW，1992．Effect of host plant on carboxylesterase activity in cotton aphid Aphis gossypii Glov．Acta Entomologica Sinica，5(3):267－272．

Gennadius P，1889．Disease of Tobacco Plantations in the Trikonia:The aleurodid of Tobacco．Ellenike Georgia，5:1－3．

Li X，Schuler MA，Berenbaum MR，2007．Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics．Annu．Rev．Entomol．，52:231 －253．

Lindroth RL，1989．Host plant alteration of detoxification activity in Papilio glaucus．Entomol．Exp．Appl.，50:29 －36．

Oliveira MRV，Henneberry TJ，Anderson P，2001．History，current status，and collaborative research projects for Bemisia tabaci．Crop Protection，20(9):709 －723．

Secker AE，Bedford ID，Markham PG，1998．Squash，a reliable field indicatior for the presence of B biotype of tabacco whitefly，Bemisia tabaci．British Crop Protection Council，837 －842．

van Asperen K，1962．A study of housefly esterase by means of a sensitive colorimetric methos．J．Insect Physiol.，8:401－416

Wang H，Wang DS，Yang YZ，Li LY，2007．Effects of host plants on enzymes related to pesticide resistance of Bemisia tabaci．Plant Pretection，33(3):36－39.［王紅，王冬生，楊益眾，李琳一，2007.寄主植物對煙粉虱后代種群抗性相關(guān)酶活性的影響．植物保護(hù)，33(3):36－39］

Wang HH，Li X，Zhang N，2007．The variation of carboxylesterase and acetylcholinesterase of Bemisia tabaci after host plant transferring．Plant Protection and Modern Agriculture——China Society of Plant Protection，2007 Conference Proceedings，25－30.［王海鴻，李雪，張妮，2007．寄主轉(zhuǎn)換后B型煙粉虱羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活力的變化，植物保護(hù)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——中國植物保護(hù)學(xué)會2007年學(xué)術(shù)年會論文集，25－30］

Zhou FC，Li CM，Zhou GS，Gu AX，Wang P，2010．Responses of detoxification enzymesin Bemisia tabaci(Genadius)to host shift．Acta Ecologica Sinica，30(7):1806－1811.［周福才，李傳明，周桂生，顧愛祥，王萍，2010．煙粉虱體內(nèi)幾種抗性酶對寄主轉(zhuǎn)換的響應(yīng)．生態(tài)學(xué)報，30(7):1806－1811］