苯并(a)芘對體外培養(yǎng)人淋巴細胞免疫活性和HSP70的影響

單士剛,包永芬

(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖北 咸寧 437100)

有害性多環(huán)芳烴化合物,如苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]是普遍存在的環(huán)境污染物,主要來源于香煙和含碳有機物的不完全燃燒.B(a)P不僅對機體呼吸系統(tǒng)有影響,而且還可以損傷免疫系統(tǒng),對人類健康的影響主要表現(xiàn)在遺傳損傷、致癌和免疫毒性等[1].目前認為B(a)P對機體的損傷可能與代謝和細胞毒性之間有一定的關(guān)系.其中重要的途徑可能是代謝活化、引發(fā)自由基和氧化應(yīng)激以及干擾細胞第二信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的正常運行等,從而影響細胞的活性,最終導(dǎo)致機體的損傷[2-4].本實驗以體外培養(yǎng)的淋巴細胞株為研究對象,不同濃度B(a)P(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)染毒16 h,分別用MTT(四甲基氮唑藍,methylthiazolyltetrazolium)法、Elisa和Western blot法檢測淋巴細胞細胞活力、細胞因子分泌以及熱休克蛋白70(heat shock proteins70, HSP70)表達情況,為今后評估人群接觸B(a)P對免疫系統(tǒng)的毒性和應(yīng)激作用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1細胞株和試劑人B細胞轉(zhuǎn)化淋巴母細胞系721.221購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心.胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均為美國Gibco公司產(chǎn)品；MTT和B(a)P購自美國Sigma公司；IFN-α、interleukin-1α和interleukin-6 ELISA試劑盒(Pierce,美國),鼠抗人單克隆HSP70,鼠抗人β-actin單克隆,辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG (武漢博士德公司),其他試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2細胞培養(yǎng)與染毒721.221細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).取對數(shù)生長期721.221細胞,設(shè)不同濃度的B(a)P染毒組(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)、溶劑對照組(1‰DMSO, 3‰S9)和空白對照組(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基).

1.3MTT試驗取對數(shù)生長期721.221細胞,以每孔5.5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板.設(shè)不同濃度的B(a)P 染毒組(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)、溶劑對照組(1‰DMSO, 3‰S9)和空白對照組(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基).每組設(shè)6個復(fù)孔,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h.取出培養(yǎng)板,每孔加入20 μL MTT(終濃度為0.05 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出培養(yǎng)板于1 800 r /min離心10 min,棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min至形成的紫色結(jié)晶完全溶解,在570 nm處測定吸光度(OD值),按以下公式計算細胞生長率,以反映細胞的增殖活性.

相對光密度值(ROD)=OD實驗組/OD對照組×100%

1.4細胞因子的檢測取2×106個細胞,加入不同濃度的B(a)P (0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L),設(shè)溶劑對照組(1‰DMSO, 3‰S9)和空白對照組(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基).每組設(shè)6個復(fù)孔.共同作用16 h后收集培養(yǎng)基上清,按照操作說明書用IFN-α、IL-1α和IL-6 ELISA試劑盒檢測.

1.5Westernblot法檢測HSP70蛋白表達水平收集處理后的721.221細胞,用冰裂解液裂解細胞,以Lowry 法進行總蛋白定量,50 μg樣品與上樣緩沖液混和,于8% SDS-PAGE中進行電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜(孔徑0.45 μm).用含5%脫脂奶粉的緩沖液 (Tris-Buffered Saline Tween-20,TBST)封閉,37 ℃孵育1 h.TBST洗3次,10 min/次.鼠抗人HSP70用含5%脫脂奶粉的TBST按1∶400稀釋,鼠抗人β-actin單克隆抗體用含5%脫脂奶粉的TBST按1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜.TBST洗滌3次,10 min /次；HRP標記羊抗鼠IgG用含5%脫脂奶粉的TBST按1∶1 000稀釋,37 ℃孵育1 h,TBST洗滌.用ECL檢測蛋白的表達,凝膠成像系統(tǒng)照相保存.

2 結(jié)果

2.1細胞的增殖活性圖1可見,與溶劑對照組比較,0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L B(a)P染毒組細胞的增殖活性均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).且隨著B(a)P染毒濃度的升高,細胞的增殖活性呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組細胞的增殖活性達到峰值,與溶劑對照組相比,增加了40%.

圖1 不同濃度B(a)P處理細胞16 h的生長曲線與溶劑對照組比較, * P< 0. 05.

2.2細胞因子檢測由圖2(A、B)知,細胞經(jīng)過B(a)P處理后,IL-1α和IL-6分泌隨著染毒濃度的增加而降低,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.由圖3知,細胞經(jīng)過B(a)P處理后,低濃度時IFN-α分泌隨著染毒濃度的增加而增加,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,且隨著B(a)P染毒濃度的升高,IFN-α分泌呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組分泌達到峰值,隨后降低.

圖2 不同濃度B(a)P處理細胞16 h后的IL-1α(A)、IL-6(B)分泌情況與溶劑對照組比較, *P<0.05.

2.3B(a)P染毒對721.221細胞HSP70表達的影響如圖4所示,不同劑量B(a)P(終濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)作用細胞16 h后,與溶劑對照組相比,低濃度時HSP70表達隨濃度增加而增加,1.000 μmol/L達到最大值,隨后降低,呈劑量依賴性.

圖3 不同濃度B(a)P處理細胞16 h后的IFN-α分泌情況(與溶劑對照組比較, *P<0.05)

圖4 不同濃度B(a)P對淋巴細胞HSP70表達的影響(μmol/L)

3 討論

B(a)P是一種廣泛存在于環(huán)境中的具有致癌作用的多環(huán)芳烴類化合物.自Stijernsward[5]發(fā)現(xiàn)其對小鼠體液免疫功能有抑制作用以來,國內(nèi)外學(xué)者對B(a)P的免疫毒性進行了大量的研究,結(jié)果表明B(a)P不僅具有明顯的體液免疫毒性,而且也有一定的細胞免疫毒性[6-9],從而影響細胞的正常功能.

熱應(yīng)激蛋白(heat stress proteins, HSPs)是機體在各種應(yīng)激因素(高溫、毒物、缺血、缺氧等)作用下, 啟動熱應(yīng)激蛋白基因,選擇性合成的一組高度保守的蛋白質(zhì)；其中HSP70是人們研究比較深入的一種蛋白質(zhì),它能保護機體細胞免受應(yīng)激因素的損害,賦予細胞或生物從各種應(yīng)激中恢復(fù)的能力和保護它們免遭這些應(yīng)激因素的損害[10].細胞實驗和流行病學(xué)研究表明HSP70蛋白表達水平與DNA損傷有較強的負相關(guān)性[11-12].

本研究重點闡述了B(a)P對體外培養(yǎng)淋巴細胞細胞因子分泌和HSP70表達的影響,可為研究B(a)P對機體免疫毒理學(xué)和對機體應(yīng)激系統(tǒng)的影響提供重要的實驗依據(jù).本研究發(fā)現(xiàn),與溶劑對照組比較,低劑量時(0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L)細胞的增殖活性均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且隨著B(a)P染毒濃度的升高,細胞的增殖活性呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組細胞的增殖活性達到峰值,與溶劑對照組相比,增加了55%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).隨著染毒劑量(2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)的增加,B(a)P顯著抑制細胞活力.細胞經(jīng)過B(a)P處理后,IL-1α和IL-6分泌隨著染毒濃度的增加而降低,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05),呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.低濃度時IFN-α分泌隨著染毒濃度的增加而增加,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；且隨著B(a)P染毒濃度的升高,IFN-α分泌呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組分泌達到峰值,隨后降低.本研究發(fā)現(xiàn)隨著B(a)P染毒濃度的升高,HSP70的表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,結(jié)果提示B(a)P在低濃度時可以引起細胞的應(yīng)激體系,降低B(a)P對細胞造成的損傷,高劑量時B(a)P對淋巴細胞DNA造成不可修復(fù)的損傷,從而抑制HSP70的表達,這和文獻報道[11-12]的生物體在接觸一般毒物應(yīng)激時HSP70表達水平與DNA損傷有較強的負相關(guān)性.總之,本實驗結(jié)果表明B(a)P高劑量時不僅對細胞活力產(chǎn)生抑制作用,同時也通過影響細胞因子的分泌,從而影響免疫細胞的正常生理功能,導(dǎo)致機體免疫功能紊亂,促進腫瘤的發(fā)生,并且通過影響機體應(yīng)激系統(tǒng),促進腫瘤的發(fā)生.但是B(a)P如何通過影響免疫細胞的應(yīng)激系統(tǒng),可能導(dǎo)致細胞因子分泌變化的機制有待研究,從而為進一步闡明B(a)P對機體免疫損傷提供依據(jù).

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