毛細(xì)管氣相色譜內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定奶粉中亞麻酸、ARA、EPA和DHA

黃杰，余孔捷，錢疆，王丹紅，蔡姍姍，薛芝敏

(福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建福州，350001)

研究表明，亞麻酸、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是必需脂肪酸，具有多種保健功效，DHA更被稱為“腦黃金”，廠家在嬰幼兒奶粉中添加亞麻酸、ARA和DHA成為了商品賣點(diǎn)。由于這些脂肪酸在食品中含量低，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，對(duì)測(cè)定方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性提出了更高的要求?，F(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法尚無(wú)內(nèi)標(biāo)法［1］。以往文獻(xiàn)中有使用十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物［2－3］，缺點(diǎn)是奶粉中含有該成分［4］，其色譜峰位置與被測(cè)組分相距較遠(yuǎn);有使用三苯乙烯為內(nèi)標(biāo)物［5］，缺點(diǎn)是其為有毒有害物質(zhì)，理化性質(zhì)與被測(cè)組分完全不同。二十一烷酸甲酯則基本符合內(nèi)標(biāo)物的理想條件，為此本研究建立了氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，可同時(shí)測(cè)定奶粉中亞麻酸、ARA、EPA和DHA含量，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀，Agilent 6890N(配FID檢測(cè)器);分析天平，上海梅特勒-托利多公司 AE240型(精度0.000 01 g)。

亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA和二十一烷酸等甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，上海安譜科學(xué)有限公司，平時(shí)置于4℃冰箱保存，臨用時(shí)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液;亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA等甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)需要濃度用正庚烷為溶劑配制;二十一烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液(2.039 mg/mL)，用甲苯為溶劑配制;氫氧化鉀-甲醇溶液(2 mol/L)，用甲醇為溶劑配制。正庚烷、甲苯、甲醇、氫氧化鉀均為AR級(jí)。

1.2 試樣及其前處理

奶粉應(yīng)密封冷藏。檢測(cè)時(shí)準(zhǔn)確稱取試樣1.500 g于50 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，準(zhǔn)確加入1.00 mL內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻，再加入4 mL正庚烷，搖勻。

甲酯化處理:于上述棕色容量瓶?jī)?nèi)加入5 mL氫氧化鉀-甲醇溶液，室溫下不斷搖勻20 min，再加入蒸餾水使液面接近容量瓶口，加塞靜置約1 min分層后，加入2滴無(wú)水乙醇于液面，加塞并以封口膠膜密閉，于冰箱內(nèi)靜置過夜，取上清液為測(cè)試液供氣相色譜儀檢測(cè)。

選用各種品牌奶粉6份，密封罐裝商品。按本法測(cè)定，每份平行3次，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3 色譜分析條件

CP-Sil88FAME石英毛細(xì)管柱，100 m×0.25 mm×0.20 μm;載氣，高純氮?dú)?99.999%);柱溫，采用程序升溫:初始溫度140℃，保持5 min，再以2℃/min速率，升溫至220℃，保持13 min;進(jìn)樣口溫度為250℃，壓力為160 kPa，分流比為30∶1;檢測(cè)器溫度為280℃，氫氣為40 mL/min，空氣為300 mL/min。進(jìn)樣量為 1 μL。

1.4 線性試驗(yàn)

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)嬰幼兒配方奶粉的要求［6］及奶粉樣品的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，配制不同濃度范圍的4種被測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(詳見表1)。準(zhǔn)確吸取5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL棕色容量瓶，進(jìn)行甲酯化處理，制得測(cè)試液;平行試驗(yàn)3份。測(cè)定值取平均值，計(jì)算線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)校正因子;根據(jù)色譜基線信噪比S/N=3計(jì)算檢出限。

1.5 回收試驗(yàn)

選用低含量亞麻酸、不含ARA、EPA和DHA的奶粉樣品進(jìn)行試驗(yàn)。加標(biāo)組:稱取試樣1.500 0 g于50 mL棕色容量瓶，準(zhǔn)確加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液;分別準(zhǔn)確加入4種標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL(添加量詳見表3)，搖勻后，進(jìn)行甲酯化處理、制得測(cè)試液;平行試驗(yàn)6份。試樣組:步驟同“加標(biāo)組”，但不加入4種標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入4 mL正庚烷。根據(jù)加標(biāo)組和試樣組的測(cè)定值，計(jì)算回收率和變異系數(shù)(CV)。

1.6 結(jié)果計(jì)算

根據(jù)某標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液濃度和用量及其色譜峰面積，計(jì)算某標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)校正因子fi:

式中Ms和As為某標(biāo)準(zhǔn)溶液中某標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量(mg)及其峰面積;Mi和Ai為某標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量(mg)及其峰面積。

根據(jù)測(cè)試液中某被測(cè)組分色譜峰面積及內(nèi)標(biāo)溶液濃度和用量及其色譜峰面積，計(jì)算試樣中某被測(cè)組分含量X，計(jì)算公式為:

式中:Mci和Aci為測(cè)試液中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量(mg)和色譜峰面積;Ac為測(cè)試液中某被測(cè)組分的色譜峰面積;M為試樣稱取量(g);測(cè)定值應(yīng)由脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)換為脂肪酸，故乘以系數(shù)Q1，再由脂肪酸轉(zhuǎn)換為脂肪酸甘油三酯，故除以系數(shù) Q2(亞麻酸的 Q1為0.952 0，Q2為0.956 0;ARA 的 Q1為 0.956 0，Q2為0.959 7;EPA 的 Q1為0.955 7，Q2為0.959 2;DHA的 Q1為 0.959 0，Q2為 0.962 4)［1］。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理、檢測(cè)結(jié)果及其色譜圖

內(nèi)標(biāo)溶液使用甲苯為溶劑，目的是提高溶脂效果，這與國(guó)標(biāo)方法［1］相一致。使用棕色容量瓶做甲酯化反應(yīng)容器的優(yōu)點(diǎn):1是避光;2是樣液與試劑約10 mL混合液在50 mL容量瓶?jī)?nèi)易于反復(fù)搖勻，使之反應(yīng)充分，避免水浴加熱，降低熱分解作用;3是加入蒸餾水后，使上層有機(jī)相進(jìn)入細(xì)窄瓶頸，有利于兩相分離，同時(shí)使液面接近瓶口，減小瓶?jī)?nèi)上層液面與瓶塞之間的空間，降低氧氣分解作用，可不需充氮?dú)?。滴加乙醇有加速上層有機(jī)相澄清的作用。

通常天然奶源的奶粉含有少量亞麻酸，而ARA、EPA和DHA含量極微，因而把亞麻酸、ARA、EPA和DHA作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑加入奶粉中，生產(chǎn)出嬰兒配方、幼兒配方等多種奶粉，其中以添加ARA和DHA價(jià)值最高，表1列出了各種奶粉的測(cè)定結(jié)果。

表1 各種奶粉樣品的測(cè)定結(jié)果(n=3)

圖1為嬰兒配方奶粉樣品色譜圖、圖2為幼兒配方奶粉樣品色譜圖，C18∶3為亞麻酸、C21∶0為內(nèi)標(biāo)物、C20∶4為 ARA、C20∶5為 EPA、C22∶6為 DHA。圖1 中各脂肪酸分離良好，內(nèi)標(biāo)物色譜峰與被測(cè)組分的色譜峰位置較近。若使用十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，其色譜峰在30 min位置，與被測(cè)組分相距較遠(yuǎn);如使用二十三烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，色譜峰位置離ARA、EPA和DHA更近，但與二十碳三烯酸和二十二碳一烯酸的色譜峰難以分開;如使用二十四烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物則與EPA的色譜峰難以分開。因此二十一烷酸甲酯是較理想的內(nèi)標(biāo)物，其分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與被測(cè)組分相似，奶粉通常不含該物質(zhì)，互不干擾，而且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)易購(gòu)，純度有保證，做內(nèi)標(biāo)物使用，可以克服多不飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)易氧化、不易保存，價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)。

2.2 線性范圍及檢出限

圖1 進(jìn)口B嬰兒配方奶粉色譜圖

在測(cè)定濃度圍內(nèi)，F(xiàn)ID響應(yīng)值與被測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)物濃度的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.998以上。4種被測(cè)組分的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。根據(jù)色譜基線信噪比，計(jì)算出4種被測(cè)組分的檢出限;按本方法取樣量1.500 g及加入甲苯1 mL、正庚烷4 mL用量，以表2檢出限最大值0.003 mg/mL計(jì)算，試樣的檢出限為0.010 mg/g即1.0 mg/100 g，基本滿足國(guó)標(biāo)方法［1］的要求。

圖2 進(jìn)口C幼兒配方奶粉色譜圖

表2 線性測(cè)定與檢出限試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.3 回收率與重現(xiàn)性

由表3可見，4種被測(cè)組分的回收率為95.4%～104.7%，試樣組和加標(biāo)組的變異系數(shù)為2.168%～4.368%，表明本方法的準(zhǔn)確性、精密度均良好。應(yīng)注意的是，由于試樣中DHA、EPA、ARA和亞麻酸的含量通常較低，在使用儀器軟件平臺(tái)對(duì)被測(cè)組分色譜峰面積進(jìn)行計(jì)算時(shí)，如采用自動(dòng)積分模式計(jì)算，可能導(dǎo)致檢測(cè)數(shù)據(jù)變化較大，建議采用手動(dòng)積分模式計(jì)算。

表3 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

目前進(jìn)口嬰幼兒奶粉占據(jù)國(guó)內(nèi)大部分市場(chǎng)，其品牌多、種類雜，品質(zhì)參差不齊。檢測(cè)亞麻酸、ARA、EPA和DHA含量是評(píng)價(jià)嬰幼兒奶粉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，本研究建立的以二十一烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜法，可同時(shí)測(cè)定奶粉中亞麻酸、ARA、EPA和DHA含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為食品安全監(jiān)管、保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益提供了可靠的檢測(cè)方法。

［1］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［S］.GB 5413.27－2010.

［2］張鳳枰，索有瑞，趙先恩，等.毛細(xì)管氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定核桃油中的脂肪酸［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19:262－267.

［3］王映強(qiáng)，賴炳森，顏曉林，等.氣相色譜法測(cè)定紫蘇子油中α-亞麻酸的含量［J］.中國(guó)生物藥物雜志，1998，19(2):91－92.

［4］劉梅森，何唯平，賴敬財(cái)，等.奶粉脂肪酸與乳制品風(fēng)味關(guān)系研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2008，36(2):13－15.

［5］吳偉都，金世梅，朱慧，等.氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定奶粉及乳飲料中的DHA和EPA［J］.中國(guó)食品添加劑，2005(1):106－108.

［6］GB10767－2010.較大嬰兒和幼兒配方食品［S］.